SNCG在卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義

肖 馳 周 雪 徐 丹 楊美英 費(fèi) 晶 鞏 平

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(石河子 832000)

卵巢癌是女性常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一[1]。全世界范圍內(nèi)每年約有23.9萬(wàn)名婦女被診斷為卵巢癌，其中15.2 萬(wàn)例患者死于卵巢癌[2]。由于卵巢位于盆腔深部，早期癌變時(shí)無(wú)特異癥狀，且目前尚無(wú)成熟的早期診斷方法，致使三分之二的患者發(fā)現(xiàn)卵巢癌時(shí)已為中晚期[3-4]。而在我國(guó)，卵巢癌的病死率居于婦科癌癥疾病首位[5]。有75%以上的患者即使是達(dá)到臨床完全緩解后，仍可在治療24個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)[6-7]，這表明卵巢癌已嚴(yán)重威脅到女性的生命健康。雖然醫(yī)療技術(shù)發(fā)展迅速，貝伐珠單抗、奧拉帕尼等靶向治療藥物在卵巢癌患者的治療中也起到了重要作用，但卵巢癌患者5年生存率仍低于50%[8]。卵巢癌的早期診斷與治療仍然是亟待解決的難題。近年來(lái)，在乳腺癌、食管癌和膀胱癌等惡性腫瘤中相繼發(fā)現(xiàn)SNCG基因異常高表達(dá)，且有大量研究報(bào)道SNCG與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系[9-10]，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于SNCG與卵巢癌相關(guān)的研究較少，因此本研究旨在探討SNCG在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)一步分析，研究SNCG的表達(dá)與卵巢癌臨床病理及預(yù)后之間的關(guān)系，探討其在卵巢癌中的作用，為臨床卵巢癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2010年1月—2015年1月間石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的具有完整臨床病理資料和石蠟切片的119例卵巢癌組織以及50例卵巢患者正常卵巢組織，依據(jù)WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤分型，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。其中漿液性腺癌89例，子宮內(nèi)膜樣腺癌14例，透明細(xì)胞癌3例，黏液性癌 4例，其他類型9例。卵巢癌患者中Ⅰ期12例，Ⅱ期22例，Ⅲ期65例、Ⅳ期14例，分期不明的6例。所有病例均經(jīng)組織學(xué)診斷，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。根據(jù)病人對(duì)鉑類藥物的敏感性，以初次治療(達(dá)到臨床緩解)停藥后6 個(gè)月為界，將復(fù)發(fā)性卵巢癌大致分為鉑類敏感型和耐藥型：①鉑敏感復(fù)發(fā)：腫瘤在鉑類為基礎(chǔ)的一線化療中有效，無(wú)化療間隔≥6個(gè)月復(fù)發(fā)者；②鉑耐藥復(fù)發(fā)：腫瘤在鉑類為基礎(chǔ)的一線治療中無(wú)效(鉑類難治型)，或化療有效但無(wú)化療間隔<6 個(gè)月復(fù)發(fā)者(鉑耐藥型)。

1.2 標(biāo)本免疫組化學(xué)染色

對(duì)119例卵巢癌患者及50例正常卵巢組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，石蠟包埋組織4 μm連續(xù)切片，65 ℃烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01 mol/L pH 8.0 EDTA緩沖液中高壓抗原熱修復(fù)，3%過(guò)氧化氫室溫避光孵育10 min抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入特異性一抗，4 ℃過(guò)夜。復(fù)溫，PBS緩沖液浸洗3次，滴加二抗，37 ℃濕盒中孵育30 min，PBS溶液浸洗3次，滴加適當(dāng)比例的 DAB顯色劑，顯微鏡下觀察，顯色 3～5 min，出現(xiàn)棕黃色顆粒后，以自來(lái)水充分沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染，蒸餾水洗滌，鹽酸酒精酸化，梯度乙醇脫水透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

1.3 結(jié)果判定

以卵巢細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特殊染色細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行評(píng)分，棕黃色顆粒狀著染的細(xì)胞數(shù)目<10%評(píng)分為0，在10%～50%之間評(píng)分為1，≥50%評(píng)分為2，進(jìn)而根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)一步分為+、++、+++，分別評(píng)分為1、2、3，總體評(píng)分≥2的免疫組織化學(xué)染色判為SNCG 陽(yáng)性，其中將棕黃色顆粒狀著染的細(xì)胞數(shù)目≥10%、染色強(qiáng)度++即總體評(píng)分≥4分的判為強(qiáng)陽(yáng)性，而總體評(píng)分<2則判為SNCG陰性。

1.4 隨訪

采用電話隨訪，隨訪截止日期2020年7月31日，隨訪時(shí)間范圍為0～126個(gè)月，至隨訪截止日，失訪6例,死亡82例，存活31例。無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)定義為從手術(shù)之日至轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)或最后一次隨訪時(shí)間；總生存期(overall survival,OS)定義為從手術(shù)之日至死亡或最后一次隨訪時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用假設(shè)檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，卵巢癌組織和正常卵巢組織中SNCG蛋白表達(dá)水平之間差異的分析以及各臨床病理特征的關(guān)系采用Pearson卡方檢驗(yàn)；單因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。多因素分析使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型模型。

2 結(jié) 果

2.1 SNCG在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)情況

在正常卵巢組織中未見(jiàn)SNCG表達(dá)(見(jiàn)圖1A)，在卵巢癌組織中SNCG表達(dá)(見(jiàn)圖1B-F)陽(yáng)性率為72.3%(86/119)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=73.575，P<0.001)。其中漿液性卵巢癌89例，陽(yáng)性率為82.0%(73/89)，高級(jí)別漿液性卵巢癌60例，陽(yáng)性率為67.4%(62/89)，非漿液性卵巢癌30例，陽(yáng)性率為43.3%(13/30)。

圖1 卵巢腫瘤及正常組織石蠟切片中SNCG的免疫組化染色注：染色方法為免疫組化法，× 200倍。圖A.SNCG在正常卵巢組織中不表達(dá)；圖B.SNCG在漿液性卵巢癌中表達(dá)；圖C.SNCG在漿液性乳頭狀癌中表達(dá)；圖D.SNCG在子宮內(nèi)膜樣癌中表達(dá)；圖E.SNCG在透明細(xì)胞癌中表達(dá)；圖F.SNCG在黏液樣癌中表達(dá)。

2.2 SNCG的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

我們分析了具有完整臨床隨訪資料的113例卵巢癌患者的臨床病理特征及其與SNCG的表達(dá)的關(guān)系(見(jiàn)表1)，在本研究中，入組患者的初診平均年齡為51.3歲(范圍為22～79歲)，發(fā)現(xiàn)SNCG的表達(dá)與患者的年齡、原發(fā)腫瘤的部位、腹水無(wú)關(guān)，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與腫瘤的組織學(xué)類型(P<0.001)、分期(P<0.001)、分化程度(P=0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.024)、CA125水平(≥175U/mL，P=0.047)、HE-4水平(≥172 pmol/L，P=0.019)、達(dá)到滿意減瘤術(shù)(P=0.033)相關(guān)。

表1 SNCG表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 SNCG的表達(dá)與卵巢癌患者復(fù)發(fā)及化療耐藥的關(guān)系

進(jìn)一步分析SNCG的表達(dá)與卵巢癌復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)至最后一次隨訪時(shí)間，入組患者中有74例患者復(fù)發(fā)，39例患者未復(fù)發(fā)，其中SNCG陽(yáng)性組復(fù)發(fā)患者占63.9%(53/83)，SNCG陰性組復(fù)發(fā)患者占70.0%(21/30)，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05，見(jiàn)表2。入組患者中有47例鉑類耐藥，66例患者鉑類敏感，其中SNCG陰性組耐藥患者占43.3%(13/30)，SNCG陽(yáng)性組耐藥患者占50.0%(34/83)，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。提示SNCG的表達(dá)與卵巢癌的復(fù)發(fā)及耐藥無(wú)關(guān)。

表2 SNCG表達(dá)與卵巢癌患者復(fù)發(fā)及化療耐藥的關(guān)系 例(%)

2.4 SNCG的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

從上述結(jié)果得出SNCG的表達(dá)與卵巢癌患者的高危臨床病理特征相關(guān)，故進(jìn)一步分析了卵巢癌患者SNCG的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果示卵巢癌患者的中位OS為40個(gè)月(95%CI:36～48月)，中位PFS為19個(gè)月 (95%CI:15～24月)。通過(guò)Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)得出SNCG的表達(dá)與卵巢癌患者的PFS無(wú)關(guān)(見(jiàn)圖2，P=0.636)、OS無(wú)關(guān)(見(jiàn)圖3，P=0.852)。由于高級(jí)別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)患者往往分期較晚，在本研究中，高級(jí)別漿液性卵巢癌60例，陽(yáng)性率為67.4%(60/89)，故進(jìn)一步分析HGSOC患者SNCG的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果示SNCG蛋白的過(guò)表達(dá)與HGSOC患者的PFS(見(jiàn)圖4)、OS(見(jiàn)圖5)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007，P=0.047)。以 HGSOC 患者的SNCG表達(dá)作為主要預(yù)測(cè)因子并調(diào)節(jié)與SNCG表達(dá)相關(guān)的臨床因素(CA125、HE-4、腹水、腫瘤分期、滿意細(xì)胞減瘤術(shù))進(jìn)行多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果示SNCG是HGSOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，與PFS(HR=2.107,95%CI：1.014～3.795，P=0.034)、OS(HR=1.238,95%CI：0.716～1.928,P=0.047)相關(guān)。即SNCG蛋白的過(guò)表達(dá)雖然與卵巢癌患者的預(yù)后無(wú)關(guān)，卻是HGSOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖2 SNCG的表達(dá)與卵巢癌患者PFS的關(guān)系

圖3 SNCG的表達(dá)與卵巢癌患者OS的關(guān)系

圖4 SNCG的表達(dá)與HGSOC患者PFS的關(guān)系

圖5 SNCG的表達(dá)與HGSOC患者OS的關(guān)系

3 討 論

突觸核蛋白是一種由127～140個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，為廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前成分內(nèi)的小分子可溶性蛋白質(zhì)家族，由α-突觸核蛋白(SNCA)、β-突觸核蛋白(SNCB)和γ-突觸核蛋白(SNCG)3 個(gè)成員組成。突觸核蛋白家族的表達(dá)與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[11]，為神經(jīng)變性疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。SNCG是該家族的第三個(gè)成員，正常情況下，SNCG表達(dá)于外周神經(jīng)元、眼組織和脂肪[12-13]，與神經(jīng)退行性疾病無(wú)明顯關(guān)系，但與腫瘤疾病關(guān)系密切。SNCG最早發(fā)現(xiàn)于人乳腺癌cDNA文庫(kù)，又稱乳腺癌易感基因1 (breast cancer gene 1,BRCA1)[14]。隨后有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SNCG在卵巢癌、肺癌、肝癌、食道癌和結(jié)腸癌[15]中的表達(dá)都會(huì)升高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，并能干擾藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。如Zengxia Ma等[16]發(fā)現(xiàn)SNCG通過(guò)AKT通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展；Paulette Mhawech-Fauceglia等[17]發(fā)現(xiàn)SNCG的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，并且高表達(dá)的患者預(yù)后不良；另外Shao T[18]等研究發(fā)現(xiàn)SNCG可通過(guò)Twist1靶點(diǎn)促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)癌細(xì)胞的遷移和侵襲，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，但是SNCG促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制目前尚未明確，這可能與腫瘤的異質(zhì)性相關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在本研究中，通過(guò)對(duì)113例卵巢癌患者的研究，我們發(fā)現(xiàn)SNCG在卵巢癌組織中高表達(dá)，這與黨榮良[19]、Anna[20]等的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SNCG過(guò)表達(dá)與卵巢癌臨床高危病理特征相關(guān)，其在III/IV期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、腫瘤標(biāo)志物升高的卵巢癌患者中表達(dá)增高(P<0.05)。由于高危臨床病理特征一般都提示預(yù)后不良，因此本研究進(jìn)一步分析其與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNCG高表達(dá)與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)(P>0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，到目前為止，涉及卵巢癌發(fā)病機(jī)制的研究通路中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和APJ信號(hào)通路是較為明確的研究通路。APJ通路的異常可通過(guò)多種下游因子促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[21]，而PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路不僅在調(diào)控細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、血管生成、轉(zhuǎn)錄、翻譯和代謝中發(fā)揮了重要作用[22]，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，其可促進(jìn)腫瘤形成、癌細(xì)胞遷移、侵襲，導(dǎo)致化療和放療耐藥的增加[23-24]。在卵巢癌中，Zhang J等[25]研究發(fā)現(xiàn)，SNCG通過(guò)PI3K/AKT通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，并可導(dǎo)致高級(jí)別漿液性卵巢癌患者預(yù)后不良；但在Anna[20]等研究中發(fā)現(xiàn)，SNCG的高表達(dá)與卵巢癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期 (HR=0.859，95%CI:0.516～1.428,P=0.557)及總生存期(HR=1.075，95%CI:0.644～1.794,P=0.783)無(wú)關(guān)。初步分析SNCG蛋白的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，得出與Anna[20]等一致的研究結(jié)果，由于HGSOC患者在就診時(shí)往往已為晚期，故推測(cè)SNCG蛋白的表達(dá)可能與HGSOC患者的相關(guān)性更大，故進(jìn)一步分析得出SNCG是HGSOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，與PFS(HR=2.107，95%CI:1.014～3.795，P=0.034)、OS(HR=1.238，95%CI：0.716～1.928,P=0.047)相關(guān)，這與Zhang J等[25]的研究結(jié)果一致。即SNCG雖不能作為卵巢癌的預(yù)后因子，卻可成為HGSOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，由于Zhang J等[25]研究表明SNCG蛋白的過(guò)表達(dá)與PI3K/AKT通路相關(guān)，這為HGSOC患者的臨床診治提供了新的靶點(diǎn)，抑制SNCG蛋白的過(guò)表達(dá)，可抑制腫瘤的進(jìn)展，從而改善HGSOC患者的預(yù)后，延長(zhǎng)生存期。

SNCG蛋白的過(guò)表達(dá)與PI3K/AKT通路的相關(guān)性研究，不僅僅只出現(xiàn)在卵巢癌中。Winder等[26]在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)抑制SNCG代表的過(guò)表達(dá)可通過(guò)AKT信號(hào)通路致使腫瘤細(xì)胞的活力降低、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Liang W等[27]的研究表明發(fā)現(xiàn)SNCG可充當(dāng)熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)的分子伴侶的功能，并在HSP90被17-AGG破壞時(shí)保護(hù)AKT和mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。另外Shao Y等[28]的研究表明過(guò)表達(dá)的SNCG蛋白可刺激雌激素依賴性的腫瘤比如乳腺癌以及卵巢癌等腫瘤的進(jìn)展，總之SNCG為一種多功能的蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。

目前NCCN指南上卵巢癌患者的常規(guī)治療方式為手術(shù)、鉑類化療以及靶向治療，但經(jīng)過(guò)系統(tǒng)治療后，仍有很多患者復(fù)發(fā)或耐藥，導(dǎo)致其死亡率高。在一些腫瘤中，比如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌，過(guò)表達(dá)的SNCG不僅可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，還可以誘導(dǎo)化療耐藥性并導(dǎo)致預(yù)后不良[29-30]。目前研究[31-32]顯示PI3K通路的激活與卵巢癌的侵襲發(fā)展、化療耐受及預(yù)后不良相關(guān)，卵巢癌的化療耐藥機(jī)制還涉及MGMT-DUB3-MCL1信號(hào)通路軸[33]。而關(guān)于SNCG蛋白過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)化療耐藥的相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，目前的研究機(jī)制主要為作用于抗微管藥物(antimicrotuble drug,AMD)比如紫杉醇、多西他賽所介導(dǎo)的耐藥。Zhang H等[34]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的SNCG通過(guò)降低卵巢癌上皮A2780細(xì)胞以及宮頸癌HeLa細(xì)胞微管的特性，從而降低腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)敏感性，導(dǎo)致AMD耐藥的發(fā)生。Miao等[35]研究發(fā)現(xiàn)SNCG可誘導(dǎo)BubR1結(jié)構(gòu)改變，減弱它與Cdc20等其他關(guān)鍵檢查點(diǎn)蛋白的相互作用，從而損害紡錘體裝配檢查點(diǎn)的功能，致使AMD耐藥的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)。但目前關(guān)于卵巢癌耐藥及復(fù)發(fā)的相關(guān)臨床研究[20,25]均未發(fā)現(xiàn)SNCG蛋白的過(guò)表達(dá)與卵巢癌的耐藥及復(fù)發(fā)相關(guān)，故本研究分析本次入組患者的復(fù)發(fā)及化療耐藥與SNCG表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示SNCG的表達(dá)與復(fù)發(fā)、化療耐藥無(wú)關(guān)(P>0.05)，即SNCG的過(guò)表達(dá)不是影響卵巢癌患者復(fù)發(fā)以及化療耐藥的因素，未得出相關(guān)結(jié)果可能是缺乏檢測(cè)SNCG蛋白更靈敏的儀器。或者可進(jìn)一步研究其在腫瘤患者血清學(xué)上的表達(dá)情況，并分析其相關(guān)性。

綜上可知，SNCG作為一種在腫瘤組織高表達(dá)的蛋白，在卵巢癌組織中也高表達(dá)，并且其表達(dá)與卵巢癌患者的高危臨床病理特征相關(guān)，與患者復(fù)發(fā)、化療耐受無(wú)關(guān)，SNCG可作為HGSOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，為臨床上HGSOC患者的診治提供了新的思路。