CYP19基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系分析

歐陽志維 馮珀霖 李翠芬 劉燕燕

東莞市松山湖中心醫(yī)院(東莞 523000)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指具有活性的子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)出現(xiàn)于子宮體以外部位，可誘發(fā)慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)、性交痛等癥狀，甚至可能在25%～35%患者中引起不孕[1-2]。EMs雖呈良性形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，但存在與惡性腫瘤類似的行為，如遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、種植侵襲、侵襲性生長及復(fù)發(fā)等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及身心健康[3]。復(fù)發(fā)是影響EMs患者患者預(yù)后及生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素，其涉及的病理學(xué)機(jī)制復(fù)雜。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，保守性手術(shù)的術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，短期1年、5年復(fù)發(fā)率分別高達(dá)33%、57%[4]，但臨床尚缺乏早期預(yù)測復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)志物。國外研究證實(shí)，EMs是一種雌激素依賴性疾病，雌激素暴露在該病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。芳香化酶p450是CYP19基因編碼的產(chǎn)物，也是合成雌激素的重要酶，由孕烯醇酮合成的睪酮、雄烯二酮可在卵巢芳香化酶刺激下轉(zhuǎn)化為雌二醇、雌酮[6]。近年來研究最多的與CYP19基因多態(tài)性相關(guān)的雌激素依賴性疾病以乳腺癌、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌等為主，關(guān)于EMs的研究報道較少。鑒于此，本研究從基因水平出發(fā)，采用PCR-RFLP技術(shù)測定不同預(yù)后EMs患者的CYP19基因115T/C、240A/G、1531C/T基因多態(tài)性差異，并分析CYP19基因多態(tài)性與術(shù)后復(fù)發(fā)等指標(biāo)的相關(guān)性，尋找易感位點(diǎn)，旨在為EMs患者的隨訪、診療提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年2月—2020年2月于我院接受手術(shù)的110例EMs患者臨床資料，按照術(shù)后12個月是否復(fù)發(fā)分為兩組。復(fù)發(fā)組年齡、病程、VAS評分相比未復(fù)發(fā)組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)發(fā)組r-AFS評分、病灶直徑及手術(shù)方式相比未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料對比

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲；符合《子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南》[7]中EMs診斷標(biāo)準(zhǔn)；r-AFS分期為Ⅲ-Ⅳ期；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：病灶直徑≥6 cm；伴有感染性疾病、代謝相關(guān)疾病或嚴(yán)重組織器官功能障礙；子宮肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜息肉、先天性子宮畸形及其他婦科惡性腫瘤；近期接受免疫抑制類及激素類藥物治療；家族性遺傳病史；凝血功能障礙；妊娠期或哺乳期。

1.3 方法

1.3.1 基因檢測 采集110例EMs患者2 mL肘靜脈血，EDTA抗凝，使用血液基因組DNA提取試劑盒(廠家：天根生化科技(北京)有限公司)對基因組DNA進(jìn)行提取。檢測所提取DNA的濃度及純度，行PCR儀(廠家：美 國Applied Bisystems 公司，型號：7700型)檢測。(1)CYP19 115T/C。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。使用2%瓊脂糖凝膠加電壓100 V電泳60～90 min，觀察電泳結(jié)果。(2)CYP19 240A/G。PCR反應(yīng)體系為 50 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。使用2%瓊脂糖凝膠加電壓100 V電泳30 min，觀察電泳結(jié)果。(3)CYP19 1531C/T。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。使用2%瓊脂糖凝膠加電壓100 V電泳30 min，觀察電泳結(jié)果。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對基因型進(jìn)行讀取。引物序列見表2。

表2 引物設(shè)計(jì)及合成

1.3.2 術(shù)后疼痛程度及病情 術(shù)后12個月通過VAS量表評估疼痛程度，0～10分，分別代表無痛至劇烈疼痛；使用r-AFS量表對病變大小、累及部位、粘連程度等進(jìn)行計(jì)分，評分1～5分為Ⅰ期(輕度)，6～15分為Ⅱ期(中度)，16～40分為Ⅲ期(重度)，>40分為Ⅳ期(廣泛)。

1.3.3 復(fù)發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后B超復(fù)查顯示典型的卵巢異位囊腫影像，即囊壁厚，單個或多個圓形或橢圓形囊腫，病灶血流豐富，囊內(nèi)未見實(shí)性或乳頭狀結(jié)構(gòu)，均一性質(zhì)的低回聲液性包塊散在細(xì)小強(qiáng)光點(diǎn)/帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

未復(fù)發(fā)組CYP19基因115T/C、240A/G、1531C/T基因多態(tài)性經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.539、1.205、0.813，P均>0.05)；復(fù)發(fā)組CYP19基因115T/C、240A/G、1531C/T基因多態(tài)性經(jīng)檢驗(yàn)結(jié)果符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=1.312、0.975、1.255，P均>0.05)，可見標(biāo)本有區(qū)域群體代表性。

2.2 CYP19基因115T/C位點(diǎn)基因型及等位基因分布

復(fù)發(fā)組CYP19基因115T/C位點(diǎn)TC、CC、TT基因型及等位基因頻率與未復(fù)發(fā)組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組CYP19基因115T/C位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況 n(%)

2.3 CYP19基因240A/G位點(diǎn)基因型及等位基因分布

復(fù)發(fā)組CYP19基因240A/G位點(diǎn)AG基因型頻率比未復(fù)發(fā)組高(OR=0.428，χ2=4.723，P=0.030)，AA基因型頻率比未復(fù)發(fā)組低(OR=4.053，χ2=10.859，P=0.001)；兩組等位基因頻率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=4.981，χ2=9.416，P=0.002)；復(fù)發(fā)組CYP19基因240A/G位點(diǎn)GG基因型頻率與未復(fù)發(fā)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組CYP19基因240A/G位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況 n(%)

2.4 CYP19基因1531C/T位點(diǎn)基因型及等位基因分布

復(fù)發(fā)組CYP19基因1531C/T位點(diǎn)CT、CC、TT基因型及等位基因頻率與未復(fù)發(fā)組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 兩組CYP19基因1531C/T位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況 n(%)

2.5 CYP19基因115T/C、240A/G、1531C/T位點(diǎn)對應(yīng)VAS評分、r-AFS評分

48例患者術(shù)后12個月的VAS評分為(3.15±1.02)分，r-AFS評分為(10.62±3.16)分。CYP19基因240A/G位點(diǎn)AG型VAS評分、r-AFS評分>GG型>AA型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CYP19基因115T/C、1531C/T位點(diǎn)不同基因型的VAS評分、r-AFS評分相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表6 CYP19基因115T/C、240A/G、1531C/T位點(diǎn)對應(yīng)VAS評分、r-AFS評分 分)

3 討 論

EMs的發(fā)病機(jī)制尚未明確，關(guān)于其來源的主要學(xué)說包括遺傳學(xué)說、誘導(dǎo)學(xué)說、子宮內(nèi)膜種植學(xué)說、靜脈及淋巴播散學(xué)說等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，EMs屬于一類雌激素依賴性疾病，在雌激素代謝過程中，相關(guān)編碼基因的突變可決定疾病的遺傳易感性，誘發(fā)雌激素合成及滅活過程紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病[9-10]。目前，針對r-AFS分期為Ⅲ-Ⅳ期的EMs患者常以手術(shù)治療為主，手術(shù)雖能在清除病灶的基礎(chǔ)上保留正常卵巢組織，但術(shù)后正常卵巢組織會分泌大量的激素，進(jìn)而為病灶繼續(xù)存活提供了條件，造成深部結(jié)構(gòu)浸潤，不利于卵巢生長發(fā)育，阻礙新生血管生成，故導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[11-12]。因此，積極探討一種診斷該疾病復(fù)發(fā)的有效、無創(chuàng)的生物標(biāo)記在改善患者預(yù)后中尤為重要。

Pan[13]等在CYP19基因與EMs間相關(guān)性中指出，CYP19 240A/G位點(diǎn)中的G的突變等位基因使EMs發(fā)病的相對風(fēng)險增加了2.463倍；郭光紅[14]等研究通過CR-RFLP及HRM技術(shù)分析CYP19基因多態(tài)性與EMs的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP19 240A/G位點(diǎn)中等位基因G突變可導(dǎo)致EMs發(fā)病風(fēng)險增加2.028倍，攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)婦女EMs的發(fā)病風(fēng)險增加4.016倍。可見CYP19 240A/G基因多態(tài)性與EMs的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為EMs診斷的有效手段，但目前少見關(guān)于外周循環(huán)中的CYP19基因多態(tài)性與EM復(fù)發(fā)之間的聯(lián)系報道。本研究中，復(fù)發(fā)組CYP19基因240A/G位點(diǎn)AG基因型頻率、等位基因分布頻率相比未復(fù)發(fā)組高有明顯差異，其中等位基因G突變可使EMs術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險增加4.981倍，攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)EMs患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險增加4.053倍，說明CYP19基因240A/G位點(diǎn)多態(tài)性與EMs患者術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。此外，CYP19基因240A/G位點(diǎn)AG型的 VAS評分、r-AFS評分>GG型>AA型，可見攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)可能會加重患者術(shù)后疼痛程度及病情。復(fù)發(fā)組CYP19基因115T/C、1531C/T位點(diǎn)不同基因型及等位基因頻率與未復(fù)發(fā)組相比未見明顯差異，且CYP19基因115T/C、1531C/T位點(diǎn)不同基因型的VAS評分、r-AFS評分相近，說明CYP19基因115T/C、1531C/T基因多態(tài)性與EMs術(shù)后復(fù)發(fā)、疼痛程度及病情無明顯相關(guān)性。CYP19基因115T/C位點(diǎn)中，攜帶C等位基因突變的基因型(TC+CC)分別與野生型TT相比，差異不顯著，證實(shí)攜帶C等位基因突變的基因型并不會增加EMs術(shù)后復(fù)發(fā)率。CYP19基因1531C/T位點(diǎn)中，與野生型CC相比，CT+TT基因型分布頻率未見明顯差異，可見攜帶T等位基因突變的基因型并非EMs術(shù)后復(fù)發(fā)的致病因素，但具體關(guān)系仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。陸聯(lián)豐[15]等結(jié)果報道，復(fù)發(fā)組CYP19基因分布頻率為93.75%，基因突變頻率為75.0%，均高于未復(fù)發(fā)組，可見CYP19基因多態(tài)性與EMs術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，與本研究結(jié)論相近。分析原因在于正常情況下，芳香化酶P450不表達(dá)于子宮內(nèi)膜中，但受盆腔發(fā)生病變等因素影響，芳香化酶P450出現(xiàn)異常表達(dá)，可在子宮內(nèi)膜中與雌激素形成正反饋環(huán)并合成雌激素，以保持內(nèi)膜細(xì)胞正常分化表達(dá)[16]；此外，芳香化酶P450表達(dá)異常時會調(diào)節(jié)炎癥因子，提升子宮內(nèi)膜中環(huán)磷酸腺苷水平，達(dá)到增強(qiáng)子宮內(nèi)膜活性、誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)的作用[17-18]。因此，CYP19基因突變后，可一定程度上增加EMs術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。

綜上所述，CYP19基因240A/G位點(diǎn)多態(tài)性與EMs術(shù)后復(fù)發(fā)、疼痛程度及病情密切相關(guān)，且攜帶G等位基因的基因型(AG+GG)可能是術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素。但本研究仍存在一定不足，如樣本量低、隨訪時間短、病例來源單一等，且僅分析CYP19基因3個位點(diǎn)多態(tài)性，未研究該基因多態(tài)性對芳香化酶功能的影響，故后期需大樣本量的多中心隨機(jī)、雙盲對照研究，并設(shè)立嚴(yán)格的病例對照研究，以進(jìn)一步分析EMs的基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)、功能變化及其與環(huán)境因素的相互作用，為疾病的診治、預(yù)后評估提供新的研究方向及理論基礎(chǔ)。