評估精子受孕能力的外顯子標記物篩選

吳瑞珊 張夢媛 劉曉華 趙文忠

廣東省計劃生育科學技術研究所(廣東省生殖醫院)國家衛生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室(廣州 510600)

全球約10%～15%育齡夫婦不育，其中50%與男方因素有關[1]。除了感染、內分泌、免疫、遺傳、先天畸形及精索靜脈曲張等病因外，有50%男性不育病因不清楚，被診斷為特發性男性不育[2]。人類精子庫和輔助生殖技術的發展很大程度上解決了男方不育方面的問題。輔助生殖技術要求人類精子庫提供高質量的精子，但是目前入庫精子質量檢測僅僅依賴于形態學檢查及生化檢測，缺乏特異性的評估方法，無法保證入庫精子的受精能力。為建立一種可靠的基于基因層面評估精子質量的方法，本項目對前期從精子庫供精標本中篩選出的高、低受孕能力精子樣本進行RNA轉錄組差異性比較研究，從差異表達恒定的外顯子中篩選多個標記物，以期為精子質量評估提供可靠的指標。

1 材料與方法

1.1 標本來源

本項目中使用的精液標本均來自廣東省人類精子庫，嚴格按照第五版WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準選取，參與項目的男性年齡介于26～42歲之間。本項目經廣東省計劃生育科學技術研究所倫理委員會同意，所有受試者都簽署知情同意書。按研究要求將16份供精標本分為高受孕能力組和低受孕能力組，各8例，用于篩選特異性外顯子引物；另外20份高受孕能力和低受孕能力供精標本用于驗證特異性引物的有效性。分組標準:高受孕能力組(g組)為已使5名婦女懷孕而供精量不超過20支的供精標本;低受孕能力組(b組)為僅使1名婦女懷孕而供精量超過20支的供精標本[3]。

1.2 儀器試劑

StepOnePlus實時定量PCR儀為Thermo Fisher公司產品；DMEM 培養液，mirVana RNA 抽提試劑盒均為Thermo Fisher公司產品；PrimeScriptDMRT reagent Kit為大連寶生物公司產品；qPCR引物由大連寶生物公司合成。

1.3 數據

測序數據來源于高受孕能力組和低受孕能力組的供精標本，經illumina 二代測序平臺測序獲得的數據，數據質量符合分析要求。

1.4 方法

1.4.1 引物設計 使用 Tophat alignment 軟件將測序所得所有 reads 與數據庫比對，并用 cufflink 軟件進行轉錄組裝。使用 R 分析軟件進行基因高低表達分析。計算基因單個外顯子表達變化倍數和P值，選擇表達量變化最大，P值最小的基因外顯子，設計特異引物。

1.4.2 精子處理 凍存的精液標本從液氮中取出后，37 ℃迅速復蘇。用 DMEM 培養液按 1:2 比例稀釋精液標本，以300×g離心10 min，棄上清。加1 mL DMEM 培養液，重懸精子，置于Percoll 液上(45% 和90%)，300×g離心20 min，收集 90%層底部精子;加1 mL DMEM 培養液，300×g離心10 min，棄上清，-80 ℃凍存。

1.4.3 cDNA制備 上述每支樣本加0.5 mL裂解結合液，充分裂解后，按 mirVana 抽提試劑盒說明提取總RNA。取4 μL 5X PrimeScript RT Master Mix，按PrimeScriptDMRT reagent Kit說明完成cDNA制備。

1.4.4 實時定量PCR引物驗證篩選 每個反應取cDNA 1 μL，TB Green Premix Ex Taq 10 μL，正向引物、反向引物各0.5 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL，補水至總體積20 μL進行PCR擴增。反應參數為：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40次循環。以MEA1和TEGT為雙參考基因，每個樣品重復三次，采用2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量。共完成31對引物驗證。

1.4.5 生物標記物的臨床驗證 將收集到的10份高受孕能力精子和10份低受孕能力精子樣本進行RNA抽提和反轉錄，選用候選引物進行實時熒光定量PCR擴增，與臨床信息比對，驗證候選引物的有效性。

1.4.6 統計學分析 數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。采用獨立樣本t檢驗比較高受孕能力組和低受孕能力組組間外顯子平均表達水平，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 引物設計結果

基于單個外顯子的表達量，選擇表達量變化最大，P值最小的基因外顯子，我們設計了31個候選基因外顯子特異性引物和2個參考基因引物(表1)。

表1 候選基因和外顯子特異性引物

2.2 基因擴增結果

選取8份高受孕能力精子和8份低受孕能力精子標本，每份樣本用31對特異性引物和2對參考引物擴增，計算ΔCt值，制作條形圖觀察外顯子表達量(圖1)。其中外顯子GAPDHS、HSF2BP、HSPA1L、ADAM21、SPEM1、WBP2NL、DDX20、TSGA10、PGK2在各組內P>0.05，表示差異無統計學意義，可認為這9個外顯子在高受孕能力組和低受孕能力組組內恒定表達。

圖1 31個基因外顯子在高、低受孕能力精子樣本中的表達差異

2.3 候選引物驗證結果

再選取10份高受孕能力精液標本和10份低受孕能力精液標本，用篩選過的9對外顯子引物進行實時定量PCR驗證。結果表明，采用GAPDHS、HSF2BP、HSPA1L、ADAM21、SPEM1、WBP2NL、DDX20、TSGA10、PGK2外顯子特異引物擴增，這9種外顯子在高、低受孕能力兩組間表達量經獨立樣本t檢驗，P<0.05，表示差異有統計學意義，可認為這9種外顯子在高受孕能力組和低受孕能力組組間表達量差異明顯(見圖2)。初步表明，9種外顯子可以作為生物標記物評估精子質量。

圖2 9種外顯子在高、低受孕能力精子樣本中的差異性表達

3 討 論

生育問題關系著每個家庭的生活質量，而全球約10%～15%的育齡夫婦正在遭受生育困難的困擾。盡管精子庫技術的發展解決了一部分男方不育的問題，但在臨床實踐中，依然會出現受孕能力低下的外供精液。這些精液按照目前的檢測指標均符合供精標準，但用于人工授精和體外受精，受孕率低，無法獲得滿意的效果[4]。精子功能測定包括頂體反應檢測、透明帶結合試驗、精子穿透試驗和精子染色質檢測等[5]。但其特異度及敏感度有待完善，且這些檢測方法無法滿足臨床中特發性男性不育病因研究和診斷的需求。準確檢測精液質量是受精成功的關鍵,這對人工授精和體外受精技術都有重要的意義。但這些精子質量檢測方法易受主觀因素影響，精確度低，對于精子受精能力的檢測缺乏可靠性，而且很難標準化[6]，故尋找新的評估方法顯得尤其重要。

精子發生與精子形成是十分復雜精密的過程，需要經過兩次減數分裂、細胞形態變異等復雜的變化，而且需要多種基因與因子在這個過程中起調控作用，任何一個基因的突變或者因子的失活都將導致精子形成發生障礙[7-8]。有研究表明精子存活而不運動，可能由于精子鞭毛缺陷，若其本身遺傳物質未發生本質變化，可進行單精子卵細胞注射也可能成功進行臨床妊娠并生育健康的嬰兒[9]，說明從基因層面評估精子質量是一種可行的方法。近些年，學者們在小鼠睪丸中篩選出300多個生精細胞特異表達基因，并通過基因敲除或RNA編輯技術對很多特異表達基因進行了研究，比如 SPEM1,KLHL10,SPATA6 等[10-14]。它們都有可能作為從基因層面評估精子質量的生物標記物。

精液中主要細胞成分為成熟精子，精子結構分為頭部、頸部、尾部，精子頭為高度濃縮的精子細胞核的核小體中，在受精過程中精子DNA失去轉錄活性，不會產生新編碼和非編碼RNA，所以精子頭中保存了大量早期生精細胞中轉錄的RNA，可用于受精過程及受精之后的胚胎發育[15]。精子中RNA是由早期生精細胞中產生的，這些編碼和非編碼RNA在受精過程中起決定性作用,因此精子中攜帶的RNA很可能決定了精子的受精能力，將可以用來評估精子的質量[16]。而且隨著RNA提取技術的日趨成熟，已解決傳統方法提取精子RNA較難裂解精子頭、導致精子RNA提取量不足的問題[3]。但是精子中的RNA不像睪丸和其他體細胞具有完整性，由于精子細胞核高度濃縮，精子頭中的RNA無法保證其完整性，呈高度片段化的RNA片段(<200 nt)，大多數以單外顯子基因的形式存在，故很難以完整的單個基因或單個外顯子基因作為評估受精能力的生物標記物，即使同一基因在不同樣本中差異表達的片段也都是有所不同的[17]。如若要尋找可作為精子質量評估的生物標記基因，則需要在不同精液質量的樣本中尋找表達差異、但表達量恒定的精子RNA片段。本項目中，我們通過分析高受孕能力組和低受孕能力組單個外顯子基因表達的差異，將每個基因分解為多個外顯子，尋找差異表達最明顯的外顯子，作為候選生物標記物。在此基礎上設計差異表達最明顯特異外顯子的引物，并通過對高受孕能力和低受孕能力精子樣本進行實時熒光定量PCR擴增，與臨床信息比對，對候選引物的有效性進行了驗證。初步確定，差異表達恒定的九種基因外顯子可作為生物標記物，為精子質量評估提供新的選項。

本項目存在不足之處是驗證樣本量太少。由于精子本身存在較大的異質性及特殊標本較難獲得，增加了本項目的難度。我們將在繼續增加樣本量的基礎上進行比較分析，進一步運用統計學方法、醫學數學模型和機器學習等技術，構建精子質量評估預測模型。