嗜熱鏈球菌S4發酵乳代謝組學的研究

馬立清,張文羿,孫天松

(乳品生物技術與工程教育部重點實驗室(內蒙古農業大學),內蒙古 呼和浩特,010018)

代謝組學在1998年由OLIVER等首次提出[1],它通過考察生物體系受刺激或擾動后,小分子質量(<1 kDa)代謝物隨時間的變化,動態監測整個生物體系代謝進程[2]。現如今已被廣泛應用于臨床醫學、中藥研究和食品科學等研究領域[3-5]。

近年來,隨著人們生活質量的提高和健康意識的增強,越來越多的消費者開始注重營養與健康,風味優良且營養豐富的發酵乳迎來了更廣闊的市場。嗜熱鏈球菌是一種廣泛應用于酸奶和奶酪發酵的微生物,在牛奶中具有良好的適應性,該特性在其基因組信息中也得到了證實[6]。嗜熱鏈球菌可在發酵過程中產生乙醛、雙乙酰、胞外多糖等次級代謝物,這些小分子物質能夠有效改善發酵乳的風味和質地,并賦予發酵乳抗菌、抗氧化和提高機體免疫力等功效[7]。盡管研究表明服用益生菌發酵乳對人體健康有益,但發酵過程復雜且難以控制,無法確定發揮營養功效的具體活性物質[8],且對發酵劑菌株的代謝特性也知之甚少。因此,基于代謝組學技術監測發酵過程中代謝產物的變化對于生產具有良好營養和感官品質的發酵乳制品及乳酸菌發酵劑的開發利用具有重要意義。

本研究選用分離自甘肅省瑪曲縣曲拉中的嗜熱鏈球菌S4作為發酵菌株,采集發酵前期(3 h,pH=6.39)、發酵中期(7 h,pH=5.12)、發酵后期(9 h,pH=4.53)的發酵乳樣品,基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)，對不同發酵階段發酵乳中差異代謝物進行研究,從代謝組學層面揭示該菌株發酵過程中的代謝特性,并對發酵乳營養價值進行評估,為嗜熱鏈球菌S4產業化生產及發酵乳品質控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱鏈球菌S4(StreptococcusthermophilusS4)由內蒙古農業大學乳酸菌菌種資源庫提供。

1.1.2 主要試劑

色譜級乙腈、甲酸、氨水,美國Sigma公司;異亮氨酸腦啡肽,美國Waters公司;脫脂乳粉,恒天然商貿(上海)有限公司。

1.1.3 主要儀器

超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜儀(ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF),美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵乳制備

10%脫脂乳粉和6.5%白砂糖混勻(均為質量分數),溶于預熱至60 ℃的蒸餾水中,完全溶解后,靜置水合30 min,95 ℃、10 min殺菌后冷卻至42 ℃。嗜熱鏈球菌S4按5.0×106CFU/mL接種量接種,37 ℃恒溫培養箱中培養至pH降至4.5時終止發酵。

1.2.2 UPLC-Q-TOF MS分析

1.2.2.1 樣品前處理

取3 mL發酵乳樣品,與乙腈溶液以3∶1的體積比均勻混合,10 000×g離心10 min;吸取2 mL上清液,與乙腈溶液再以1∶3的體積比混合,振蕩均勻,4 ℃靜置2 h;12 000×g離心5 min后取上清液蒸發濃縮至干;體積分數40%乙腈溶液復溶,經0.22 μm微孔濾膜過濾至上樣瓶中,上機測定。9份發酵乳各取2 mL混于50 mL離心管內,與待測樣品以同樣的方式進行處理后作為質量控制樣品。

1.2.2.2 色譜、質譜條件

選用Acquity UPLC?HSS C18色譜柱,設置柱溫45 ℃,樣品室溫度10 ℃,流速0.3 mL/min,進樣量5 μL。正離子模式掃描下:流動相A為H2O+0.1%甲酸,B為乙腈+0.1%甲酸;負離子模式掃描下:流動相A為H2O+0.1% NH4·OH溶液,B為純乙腈,梯度洗脫條件見表1[9]。

采用ESI源正離子(ESI+)與負離子(ESI-)模式掃描,掃描范圍設定在m/z50～1 000。采用質量濃度為2 μg/L的異亮氨酸腦啡肽進行實時質量校正,正離子模式下鎖定質量數m/z556.277 1,負離子模式下鎖定質量數m/z554.261 5。設定毛細管電壓2.5 kV、樣品錐孔電壓40 kV、源溫100 ℃、脫溶劑氣溫度350 ℃、錐孔氣流速50 h/L和脫溶劑氣流速600 h/L[10]。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions

1.2.2.3 數據處理及多元統計分析

UPLC-QTOF MS獲得的原始數據經轉化及預處理后,使用MetaboAnalyst 4.0在線軟件進一步對數據進行標準化處理,使數據更具可比性。模式識別分析采用SIMCA 14.0軟件完成,最終結合P<0.05,變量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)≥1以及兩組間的差異倍數≥2等條件篩選獲得差異代謝物,并使用MetaboAnalyst 4.0結合KEGG數據庫進行代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌S4發酵乳代謝組學分析

2.1.1 數據質控分析

質量控制在大規模代謝組學研究中具有重要作用,通常通過分析質控樣本隨時間變化情況來評估代謝組學數據的質量及儀器的穩定性。圖1-a、圖1-b分別為正負離子掃描模式下所有質控樣本的變化趨勢,不難看出所有的質控樣品變化均很小(<±2SD)。圖1-c、圖1-d中,全部質量控制樣品聚為一簇,且與受試樣品有明顯區分,進一步證明數據采集過程中試驗條件合理且儀器穩定性好。

a-ESI+質控樣本的變化趨勢圖;b-ESI-質控樣本的變化趨勢;c- ESI+主成分分析圖;d-ESI-主成分分析圖圖1 質控樣本評估Fig.1 Assessment of quality control sample

2.1.2 嗜熱鏈球菌S4發酵乳主成分分析

本研究利用主成分分析方法,通過將多維數據轉化成幾個綜合主成分來評估樣品的分組情況。由圖2可知,所有質量控制樣本聚集成一簇,說明數據采集過程中儀器及試驗條件穩定,所得數據準確可靠。不同發酵階段發酵乳樣品組內聚集緊湊,距離較小,說明測定結果重復性較好。且不同發酵階段發酵乳樣品組間區分明顯,距離較大,說明不同發酵階段發酵乳樣品具有明顯差異,隨著發酵時間的延長,發酵乳體系內代謝物發生明顯變化。

a-ESI+;b-ESI-C-發酵前期;D-發酵中期;W-發酵后期;QC-質控樣本(下同)圖2 不同發酵階段發酵乳的主成分得分圖Fig.2 PCA score plots of fermented milk at different fermentation stages

2.1.3 嗜熱鏈球菌S4發酵乳正交偏最小二乘判別分析

為準確獲得兩組間差異代謝物,本研究又采用正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)有監督的判別方法對不同發酵階段發酵乳進行分析。由圖3、圖4和圖5可知,正負離子模式下,發酵前期、發酵中期和發酵后期每兩組間分離效果良好。OPLS-DA具體參數結果如下,圖3-a:Q2=0.968,R2Y=0.999;圖4-a:Q2=0.992,R2Y=1.000;圖5-a:Q2=0.988,R2Y=1.000(本文僅提供具有代表性的正離子模式結果)。其中Q2表示該模型的預測能力,R2Y表示該模型的解釋能力,Q2和R2Y越接近1表示模型越可信,越理想。本試驗中各模型的解釋率和預測率均在0.9以上,表明模型建立成功,具有指導意義。在S-plot中,每個小黑點代表1個變量,離原點越遠的變量貢獻越大,差異越明顯,越有可能成為潛在生物標記物。圖中小紅框標出代謝物的VIP值≥1,這些物質將進一步結合差異倍數和顯著性差異參數進行再次篩選。

a-OPLS-DA圖;b-S-plot圖3 發酵前期VS發酵中期OPLS-DA圖和S-plot圖Fig.3 OPLS-DA plot and S-plot of pre-fermentation phase VS mid-fermentation phase

a-OPLS-DA圖;b-S-plot圖4 發酵中期VS發酵后期OPLS-DA圖和S-plot圖Fig.4 OPLS-DA plot and S-plot of mid-fermentation phase VS end-fermentation phase

a-OPLS-DA圖;b-S-plot圖5 發酵前期VS發酵后期OPLS-DA圖和S-plot圖Fig.5 OPLS-DA plot and S-plot of pre-fermentation phase VS end-fermentation phase

值得一提的是,OPLS-DA極易出現所創模型過度擬合的情況,因此需要對模型可靠性進行驗證。驗證方法為將原本的分組標簽去除并打亂,隨機置換200次得到置換檢驗圖。置換檢驗得到的回歸直線與Y軸的截距可作為評估模型是否過擬合的標準。通常R2的截距應明顯小于模型變量的解釋度,Q2的截距也應該明顯小于預測度,即回歸直線的斜率>1。由圖6可知,3個模型中回歸直線的斜率均>1,說明本次試驗數據不存在過度擬合。且Q2與Y軸的截距小于0,說明模型穩健,結果可信度高。

2.1.4 嗜熱鏈球菌S4發酵乳差異代謝物鑒定結果

高通量的代謝組學數據分析和功能解釋仍是目前限制非靶向代謝組學技術的主要因素,為了獲得盡可能準確的差異代謝物,本研究使用MetaboAnalyst 4.0在線軟件中的MS Peaks to Pathway模塊實現了從質譜峰直接預測生物功能活性,該方法繞過了主觀鑒定差異代謝物環節,使預測結果更可靠[11]。并在此基礎上結合VIP≥1,差異倍數≥2,P<0.05等基本篩選原則共同確定不同發酵階段發酵乳的差異代謝物,鑒定結果見表2、表3和表4。

a-發酵前期 VS 發酵中期；b-發酵中期 VS 發酵后期；c-發酵前期 VS 發酵后期圖6 不同比較組間的置換檢驗分析Fig.6 The permutation test analysis between different comparison group

表2 發酵前期和發酵中期差異代謝物Table 2 Significantly different metabolites between pre-fermentation phase and mid-fermentation phase

表3 發酵中期和發酵后期差異代謝物Table 3 Significantly different metabolites between mid-fermentation phase and end-fermentation phase

續表3

表4 發酵前期和發酵后期差異代謝物Table 4 Significantly different metabolites between pre-fermentation phase and end-fermentation phase

由表2～表4可知,發酵過程中,維生素類吡哆胺含量一直顯著增加,脫硫生物素含量發酵中期開始顯著增加。人體必需氨基酸類L-苯丙氨酸含量一直顯著增加,L-賴氨酸和色氨酸含量發酵中期開始顯著增加,其他氨基酸類L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和酪氨酸含量發酵中期開始顯著增加。由此可見,氨基酸代謝主要發生在發酵中后期。除此之外,D-半乳糖、膽堿、6,7-二甲基-8-核糖醇基-2,4-二氧四氫蝶啶(DRL)等含量呈現下降趨勢。

2.1.5 嗜熱鏈球菌S4發酵乳代謝通路富集分析

利用MetaboAnalyst 4.0中的Enrichment Analysis模塊,對表2～表4鑒定到的差異代謝物進行代謝通路富集分析。由圖7可知,發酵前期為乳酸菌生長遲滯期,產生的代謝物較少,因此涉及到的代謝通路較少;發酵后期代謝過程復雜,產生的代謝物質較多,涉及的代謝通路也相對較多。代謝通路主要集中在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,苯丙氨酸代謝,磷酸戊糖途徑,維生素B6代謝,半乳糖代謝等代謝途徑。

a-發酵前期 VS 發酵中期；b-發酵中期 VS 發酵后期；c-發酵前期 VS 發酵后期圖7 不同比較組間的差異代謝物富集分析Fig.7 The enrichment analysis of differencial metabolites between different comparison group

3 討論

3.1 維生素

本研究中,吡哆胺和脫硫生物素含量顯著增加,DRL含量顯著下降。維生素B6包括吡哆醇、吡哆胺和吡哆醛3種形式,在生物體內三者可以相互轉化[12]。3種化合物的磷酸酯都具有生物活性,在氨基酸代謝中具有重要作用,醛亞胺中間復合物起到中間樞紐作用。脫硫生物素是合成生物素所必須的前體物質,轉化過程中硫原子由生物素合成酶的Fe-S簇提供[13]。生物素在高等動物新陳代謝過程中不可或缺,但無法自身合成,只能通過自身微生物合成或從食物中獲得[14],生物素廣泛存在于牛奶、肝、谷類、蔬菜等食物中。DRL是核黃素合成的直接前體物質,2分子DRL可通過歧化反應生成核黃素。有研究表明乳酸乳球菌和發酵乳桿菌等乳酸菌可以生物合成核黃素[15-16],該物質具有重要生理功能,是保證機體正常代謝的必需物質。

3.2 碳水化合物

嗜熱鏈球菌可代謝利用多種碳水化合物,但對乳糖的偏好性最強[17]。乳糖是牛乳中主要的碳水化合物,乳糖不耐癥患者因體內缺少乳糖酶,不能分解利用乳糖,而引起腹瀉、脹氣等不良反應。發酵乳中乳酸菌能夠利用乳糖產生乳酸,滿足乳糖不耐癥患者對牛乳的營養需求[18]。本研究中,D-半乳糖含量有所下降,這是因為乳糖在乳糖酶的作用下分解為半乳糖,半乳糖經轉化生成1-磷酸葡萄糖和UDP-半乳糖,隨后進入糖酵解途徑產生能量。D-半乳糖是廣泛存在于哺乳動物乳汁中,但有研究發現長期D-半乳糖誘導的小鼠會出現壽命縮短、神經損傷、認知能力下降等癥狀[19]。由此可見,嗜熱鏈球菌S4具有降解牛乳中潛在有害物質的作用。7-磷酸景天庚酮糖是磷酸戊糖途徑的中間體,嗜熱鏈球菌是兼性厭氧菌,非氧化反應階段,5-磷酸核酮糖又轉變為5-磷酸核糖和5-磷酸木酮糖。在轉酮酶的作用下,2分子5-磷酸核糖和2分子5-磷酸木酮糖反應生成7-磷酸景天庚酮糖[20]。NAGY等[21]認為7-磷酸景天庚酮糖是磷酸戊糖途徑中的重要中間產物,起到糖酵解和磷酸戊糖途徑交界處碳通量變阻器作用。

3.3 氨基酸

嗜熱鏈球菌因具有細胞壁蛋白酶基因PrtS,能夠利用蛋白水解系統水解牛乳中的酪蛋白為肽類及氨基酸,供機體生理代謝需要。此外,一些氨基酸還可進一步轉化為醛酮類等風味物質,游離氨基酸的種類和數量對酸奶的品質和風味具有重要影響[22]。本研究中L-苯丙氨酸、L-賴氨酸和色氨酸等人體必需氨基酸含量均顯著增加。由此可見,嗜熱鏈球菌S4發酵乳是補充人體必需氨基酸的良好來源。黃珊[23]基于轉錄組學和代謝組學對嗜熱鏈球菌TF96氨基酸代謝機制進行了研究,結果表明大部分常見氨基酸濃度呈現上升趨勢,與本研究結果一致。此外,苯丙氨酸可經轉氨反應生成苯丙酮酸,發酵過程中苯丙酮酸含量呈現上升趨勢,苯丙酮酸進一步在脫氫酶的作用下還原為苯乳酸,大量文獻證明植物乳桿菌能夠代謝產生苯乳酸[24-26]。苯乳酸是一種天然廣譜生物抑菌劑,其因生物合成反應條件溫和且副產物少而逐漸引起了人們的關注。它不僅可以延長發酵乳制品的貨架期,還可抑制人體內致病菌生長,現已被廣泛應用于食品、醫藥等領域[27]。

酪氨酸含量從發酵中期開始顯著增加,酪氨酸通過兒茶酚胺途徑經左旋多巴脫羧酶和β-羥化酶作用生成去甲腎上腺素[23],因而發酵后期去甲腎上腺素含量升高。去甲腎上腺素是一種重要的單胺類神經遞質,參與多項生理過程,可用于治療急性心肌梗塞或體外循環術后引起的低血壓等[28]。發酵乳中氨基酸的種類及數量被認為是評估產品營養質量的重要指標,KANG等[8]基于LC-MS技術對發酵大豆食品(meju)發酵過程中的代謝物變化進行全面研究,共鑒定出包括賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸等在內的22個潛在生物標記物,并提出了初步的meju發酵代謝途徑。

3.4 其他代謝產物

膽堿是認知發育、新陳代謝、肝功能和同型半胱氨酸代謝調節的重要營養素,是合成神經遞質、乙酰膽堿、甜菜堿和磷脂的必需物質。膽堿可在人體肝臟中少量合成,但不足以滿足人體需要,必須由食物供給[29]。本研究中膽堿含量降低,甜菜堿含量增加,說明發酵過程激發了滲透調節機制,膽堿不可逆的氧化為甜菜堿。該結果與DILGER等[30]的研究結果一致,膽堿的減少量用于甜菜堿的合成。甜菜堿是一種滲透劑和甲基供體,具有調節細胞體積和組織完整性、維持水分平衡等作用[31-32]。作為甲基供體,甜菜堿通過甜菜堿-同型半胱氨酸S-甲基轉移酶作用使同型半胱氨酸再甲基化為蛋氨酸和二甲基甘氨酸,二甲基甘氨酸進一步去甲基化產生肌氨酸,隨后被代謝為甘氨酸,導致碳單元轉入葉酸庫[33]。有研究表明甜菜堿可抑制急性肝衰竭小鼠的Toll樣受體4反應并有助于恢復腸道菌群[34]。

4 結論

本研究基于UPLC-QTOF MS技術,通過主成分分析和OPLS-DA并結合數據庫檢索及質譜信息匹配,從代謝組學層面系統分析嗜熱鏈球菌S4在牛乳中的代謝特性。發酵過程中,共篩選出包括7-磷酸景天庚酮糖、吡哆胺、賴氨酸、色氨酸等在內的24個差異代謝物。主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、維生素代謝等多條代謝途徑。嗜熱鏈球菌S4在發酵過程中產生的差異代謝物多為氨基酸、維生素、膽堿等初級代謝產物,其種類和含量對發酵乳的風味質地及營養益生特性具有積極作用。由此可見,該菌株可作為潛在發酵劑用于乳制品的生產中。