抗真菌乳酸菌的篩選及其在酸奶發酵中的應用

張穎,劉同杰,公丕民,張蘭威,王淑梅,易華西*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266000) 2(哈爾濱學院 食品工程學院,黑龍江 哈爾濱,150086)

酸奶在加工、包裝以及運輸和貯藏過程中,極易受到耐酸真菌的污染,造成安全危害、經濟損失以及品牌形象惡化[1]。其間的主要污染微生物是酵母菌和霉菌,包括青霉、曲霉、毛霉、乳酸克魯維酵母、畢赤酵母、馬克思克魯維酵母等[2-3]。乳品企業通常采用物理或化學技術控制酸奶真菌污染,物理方法諸如冷藏、輻照等,已被普遍采用;化學防腐劑經常與物理防腐技術結合使用來控制真菌的污染[4]。但是與酸奶變質相關的酵母菌等真菌,由于細胞內pH值低,對山梨酸等弱酸防腐劑具有較強抵抗力[5],保鮮效果并不理想。此外,大量使用化學防腐劑會導致真菌的抗藥能力增強,某些菌株的抗性機制已被證實具有遺傳能力[6]。因此開發安全、高效的生物防腐劑來預防和控制酸奶中的真菌污染對保障酸奶微生物安全,延長酸奶保質期具有重要意義。

乳酸菌被公認為是安全的食品級微生物[7-8]。有的乳酸菌對導致食品腐敗變質的微生物具有抑制活性,可代替化學防腐劑,具有生物防腐劑的作用[9]。然而,將這類乳酸菌作為輔助菌株用于酸奶生產,可能會對酸奶本身的感官和理化性質產生不良影響。理想情況下,被選擇的乳酸菌在保持其抗真菌性能的同時,對酸奶的穩定性和感官質量不應產生負面影響[10]。目前國內市售的商業酸奶防腐保鮮菌主要依賴進口,開發具有我國自主知識產權的酸奶防腐保鮮菌對保障和提升我國酸奶的品質與安全具有重大意義。針對這一行業問題,本研究以酸奶中常見腐敗真菌為指示菌篩選具有抗真菌活性的乳酸菌,然后將其作為輔助發酵劑用于酸奶生產,通過對應用效果進行評價,探究其作為酸奶防腐保鮮菌的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

140株乳酸菌:分離自人體腸道及乳制品,保存于中國海洋大學食品科學與工程學院功能性乳制品與益生菌工程研究室。指示菌:食品腐敗真菌(馬克思克魯維酵母、季也蒙畢赤酵母、黃曲霉)、食品腐敗細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌)、酸奶發酵劑YF-L907(保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌)。酸奶發酵劑,北京多愛特生物科技有限公司;黃曲霉保存于中國海洋大學應用微生物實驗室;馬克思克魯維酵母、季也蒙畢赤酵母、婁地青霉,中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

MRS培養基、M17培養基、PDA培養基、LB培養基、BHI培養基、脫脂乳培養基,青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 主要實驗材料

全脂乳粉、白砂糖。

1.2 儀器與設備

潔凈工作臺(SW-CJ-1D),蘇州凈化設備有限公司;乳品發酵監控儀(CINAC),法國Alliance-AMS公司;高速冷凍離心機(TG20KR-D),長沙東旺實驗儀器有限公司;真空冷凍干燥機(Alpha 1-4),德國Marin Christ公司;全自動滅菌鍋(LDZX-75KBS),上海申安醫療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗真菌乳酸菌的篩選

乳酸菌按2%接種量接種至MRS液體培養基中,37 ℃培養,每24 h活化3次,發酵液經離心(8 000 r/min,4 ℃,5 min)后,收集上清液,凍干濃縮10倍,用0.22 μm無菌濾膜過濾收集備用。

采用瓊脂平板擴散法[11]評估乳酸菌對腐敗真菌的抑制作用。在培養皿中放入無菌牛津杯,倒入20 mL含指示菌濃度為105CFU/mL的半固體培養基,待培養基完全凝固后拔出牛津杯,往孔中加入180 μL濃縮發酵上清液,室溫下擴散5 h,28 ℃培養24 h,對抑菌圈進行測量。

有機酸排除實驗:用5 mol/L NaOH溶液調乳酸菌發酵上清液pH值至6.0,排除酸干擾,測定抑菌活性。

蛋白酶敏感實驗:向上述上清液中依次加入1 mg/mL木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以及胃蛋白酶,37 ℃水浴2 h后,測定抑菌活性。

1.3.2 抑菌譜測定

使用乳品中常見腐敗真菌和細菌以及基礎發酵劑菌株作為指示菌,利用瓊脂擴散法測定抑菌活性。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態學觀察

目標菌株在固體培養基上培養至菌落形成,挑取菌落稀釋成菌液,在玻璃片上固定后,經革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態。

1.3.3.2 16S rDNA分析

使用細菌試劑盒提取總DNA,使用引物1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、引物2(5′-CTAC-GGCTACCTTGTTACGA-3′)進行PCR擴增。PCR 反應擴增條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸90 s,30次循環,72 ℃延伸10 min,PCR產物的測序由上海生工生物工程有限公司完成。測序結果于NCBI的GenBank數據庫進行BLAST比對,采用MEGA 7.0構建系統發育樹,確定分離得到的乳酸菌種屬。

1.3.4 酸奶制備

全脂復原乳(全脂乳粉120 g/L,白砂糖60 g/L)加熱至60 ℃水浴30 min,均質(65 ℃,20 MPa)后迅速分裝至錐形瓶中,在105 ℃下高溫殺菌5 min后,迅速冰浴冷卻至42 ℃接種發酵劑,恒溫發酵至pH 4.5左右,置于4 ℃下冷藏24 h后熟。

使用酸奶發酵劑YF-L907(保加利亞桿菌:108CFU/mL,嗜熱鏈球菌:108CFU/mL)與F32-2復配發酵,酸奶分為3組,F32-2 添加量分別為0、1×106和1×107CFU/mL。酸奶冷藏3 d后進行感官評價,貯藏期間于第1、7、14、21、28天測量相關理化指標和微生物指標。

1.3.5 感官評價

參照中國乳制品工業行業規范RHB 103—2004《酸牛乳感官質量評鑒細則》,選取10名評價員從色澤(10分)、組織狀態(10分)、口感與氣味(10分)等3個方面對酸奶進行感官評價。

1.3.6 酸奶理化指標測定

pH值測定:發酵期間酸奶pH使用CINAC乳品發酵監控儀跟蹤記錄,貯藏期間酸奶pH變化使用pH計測量。

可滴定酸度測定:參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》。

1.3.7 酸奶微生物指標測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》,其中乳球菌計數使用M17培養基,乳桿菌計數使用MRS 培養基。

1.3.8 抑制酸奶中腐敗真菌活性測定

霉菌抑制活性測定:將樣品(各3杯平行樣)置于28 ℃下恒溫放置4周,定期觀察有無霉菌生長并予以記錄[12]。如發現有1杯樣品中有霉菌生長,則觀察結果記錄為1。

酵母菌抑制活性測定:酸奶發酵結束后添加馬克思克魯維酵母(100±20)個/mL,置于4 ℃下冷藏4周后進行平板計數,采用孟加拉紅培養基,按照公式(1)計算酵母菌的抑制率[13]。

(1)

式中:A1,對照組酵母菌活菌數;A2,實驗組酵母菌活菌數。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0軟件對結果進行差異顯著性分析(P<0.05),采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 抗真菌乳酸菌的篩選及其抑菌譜研究

以馬克思克魯維酵母、季也蒙畢赤酵母、黃曲霉為指示菌,從140株乳酸菌篩選出具有明顯抑菌效果的菌株F32-2,其對馬克思克魯維酵母的抑菌效果最明顯。將馬克思克魯維酵母作為指示菌進一步對菌株F32-2的抑菌物質進行了初步摸索。經過酸排除實驗后,菌株F32-2的發酵上清液保留了大部分抑菌活性,但在經過不同蛋白酶處理后抑菌活性消失,初步確定主要抑菌物質為蛋白類或肽類。

進一步測定了菌株F32-2的抑菌譜,結果如圖1所示。菌株F32-2不僅對3株腐敗真菌有抑制作用,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌也表現出明顯的抑制效果。另外,菌株 F32-2對酸奶發酵劑中的主體菌株保加利亞桿菌抑制作用較小,對嗜熱鏈球菌基本無抑制,具備酸奶輔助發酵劑和酸奶保鮮菌的潛質。據此,以菌株F32-2為研究對象,開展其在酸奶保鮮中的應用研究。

圖1 菌株F32-2對季也蒙畢赤酵母 (a),馬克思克魯維酵母 (b),黃曲霉(c),大腸桿菌(d),金黃色葡萄球菌(e),李斯特菌(f),沙門氏菌(g),保加利亞桿菌(h)和嗜熱鏈球菌(i)的抑制效果Fig.1 Inhibition of strain F32-2 on Meyerozyma guilliermondii (a),Kluyveromyces marxianus (b),Aspergillus plarus (c),Escherichia coli (d),Staphyloccocus aureus (e),Listeria monocytogenes (f),Salmonella paratyphi (g), Lactobacillus bulgaricus (h),and Streptococcus thermophilus (i)

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌體形態觀察

對菌株F32-2進行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體形態如圖2所示,菌體呈短桿狀,F32-2為革蘭氏陽性桿菌。

圖2 F32-2菌體顯微鏡觀察形態(×1 000)Fig.2 Microscopic observation of F32-2 (×1 000)

2.2.2 16S rDNA分析鑒定

將菌株F32-2的16S rDNA鑒定結果在NCBI的GenBank數據庫進行BLAST比對,其與鼠李糖乳桿菌的相似度達到99%,使用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹如圖3所示,菌株F32-2與鼠李糖乳桿菌為同一分支,鑒定其為鼠李糖乳桿菌,命名為鼠李糖乳桿菌F32-2(LactobacillusrhamnosusF32-2)。

圖3 菌株F32-2的系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain F32-2

2.3 L.rhamnosus F32-2對酸奶發酵時間的影響

按1.3.4中分組制備了酸奶樣品,使用CINAC乳品發酵監控儀跟蹤記錄酸奶發酵過程的pH變化,pH隨發酵時間的動態變化曲線如圖4所示。僅接種酸奶發酵劑YF-L907的酸奶在3.8 h到達發酵終點(pH=4.5),輔助接種L.rhamnosusF32-2的2組酸奶在發酵后期pH均低于對照組。L.rhamnosusF32-2接種量為1×106和1×107CFU/mL的酸奶發酵時間分別縮短了0.3和0.5 h,表明L.rhamnosusF32-2在酸奶發酵過程中沒有對保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌產生拮抗作用,且本身也發酵產生乳酸,使酸奶提前達到發酵終點,縮短了發酵時間。

圖4 L.rhamnosus F32-2對酸奶發酵時間的影響Fig.4 Effect of L.rhamnosus F32-2 on yogurt fermentation

2.4 L.rhamnosus F32-2對酸奶感官品質的影響

感官品質是消費者接受或拒絕食品最重要的標準[14]?；?.3.5的評分標準,從酸奶的色澤、組織狀態、口感與氣味等3方面進行感官評價,評分結果如圖5所示。不同組酸奶的3個指標評分均在8～9分,組間差異不顯著(P>0.05),表明L.rhamnosusF32-2對酸奶的感官品質無顯著影響。

圖5 酸奶感官評價結果Fig.5 Sensory evaluation results of yogurt

2.5 L.rhamnosus F32-2對酸奶冷藏期間pH值和可滴定酸度的影響

在酸奶發酵結束后,乳酸菌繼續將乳糖轉變為乳酸,改變酸奶pH值和酸度[15]。圖6顯示了酸奶在4 ℃貯藏期間pH值和可滴定酸度的變化。當L.rhamnosusF32-2接種量為1×106CFU/mL,pH值和可滴定酸度與對照組酸奶無顯著性差異(P>0.05);當酸奶L.rhamnosusF32-2的接種量達到1×107CFU/mL,貯藏至第21天后,酸奶pH值顯著高于對照組(P<0.05),可滴定酸度顯著低于對照組(P<0.05)。

圖6 4 ℃下酸奶貯藏期間pH值和可滴定酸度的變化Fig.6 Changes of pH and TA of yogurt during storage at 4 ℃

貯藏時間和L.rhamnosusF32-2接種量均能影響酸奶的酸度,加大L.rhamnosusF32-2接種量,能在貯藏后期延緩酸奶的后酸化,這與酸奶貯藏期間乳酸菌的種類、數量和發酵活性有關。保加利亞桿菌是導致酸奶后酸化的主要菌株[16]。貯藏后期,L.rhamnosusF32-2增殖成為酸奶中的優勢菌,抑制了保加利亞桿菌的生長,從而一定程度上緩解了酸奶的后酸化。

2.6 L.rhamnosus F32-2對酸奶冷藏期間活菌數的影響

酸奶冷藏期間乳球菌和乳桿菌總數的變化如圖7所示。各組酸奶的乳球菌數隨著時間的延長而降低,僅接種發酵劑YF-907的對照組酸奶乳球菌總數最多。輔助接種L.rhamnosusF32-2后,酸奶中的乳球菌總數都略微減少,表明L.rhamnosusF32-2在酸奶冷藏期抑制了嗜熱鏈球菌的生長,但無顯著性差異(P>0.05)。3組酸奶中乳桿菌總數的變化趨勢一致,均先下降后上升,且始終保持在108CFU/mL之上。接種L.rhamnosusF32-2的2組酸奶的乳桿菌總數均顯著增加(P<0.05),且隨時間變化的波動幅度更小,表明L.rhamnosusF32-2的添加提高了酸奶中的乳桿菌總數。在酸奶貯藏后期,L.rhamnosusF32-2可一定程度上抑制保加利亞桿菌的生長,成為酸奶中的優勢菌群,從而使乳桿菌總數回升。LI等[12]發現干酪乳桿菌AST18的添加會提高酸奶中的乳桿菌總數,同時抑制乳球菌的生長,與實驗結果一致。

圖7 4 ℃下酸奶貯藏期間活菌數的變化Fig.7 Changes of viable count of yogurt during storage at 4 ℃

2.7 L.rhamnosus F32-2對酸奶中腐敗真菌的抑制效果

前期研究中L.rhamnosusF32-2對霉菌的抑制實驗是在培養基體系中進行,為驗證L.rhamnosusF32-2在酸奶體系中對霉菌的抑制效果,將酸奶置于常溫下貯藏。結果如表1所示,在第21天,僅接種發酵劑YF-L907的酸奶出現明顯的霉菌污染,L.rhamnosusF32-2接種量為1×106CFU/mL的酸奶在第28天出現污染,L.rhamnosusF32-2接種量為1×107CFU/mL的酸奶在貯藏期內沒有出現污染。

表1 L.rhamnosus F32-2 對酸奶中霉菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of L.rhamnosus F32-2 on mold in yogurt

貯藏28 d后的酸奶如圖8所示,YF-L907組酸奶表面長出了白色霉菌菌落,且伴隨著嚴重的乳清析出;YF-L907+F32-2(1×107)組酸奶表面保持光滑,質地均勻無明顯乳清析出,表明L.rhamnosusF32-2可有效抑制酸奶中霉菌的生長。L.rhamnosusF32-2的抑菌效果體現出劑量依賴性,當添加量達到1×107CFU/mL時,酸奶在常溫下的貯藏期能延長到28 d以上。

a-YF-L907組酸奶;b-YF-L907+F32-2(1×107)組酸奶圖8 酸奶的貨架期觀察實驗Fig.8 Shelf life saving experiment of yogurt

由于無法使用直接觀察法研究酸奶中酵母菌的生長情況,于是設置了酵母菌污染酸奶實驗。在酸奶發酵結束后接種馬克思克魯維酵母,4 ℃下貯藏28 d后進行酵母菌計數,計算酵母菌的抑制率,結果如表2所示。當L.rhamnosusF32-2 的添加量為1×106和1×107CFU/mL時,馬克思克魯維酵母菌的抑制率分別達到了39.28%和66.09%,與對照組相比酵母存活數均顯著降低,且具有劑量效應。本研究結果與郭建林等[17]的研究結果相似,酵母菌污染后能長期存活在酸奶中,保鮮菌接種量越高,貯藏結束后酵母菌數越少。DELAVENNE等[13]同樣發現,哈爾濱乳桿菌K.V9.3.1 Np對解脂耶氏酵母的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。關于L.rhamnosusF32-2對馬克思克魯維酵母的抑制機理有待進一步的深入研究。

表2 L.rhamnosus F32-2對酸奶中酵母菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of L.rhamnosus F32-2 on yeast in yogurt

3 結論

以導致酸奶腐敗變質的典型真菌為指示菌,篩選出1株具有明顯抑制真菌活性的L.rhamnosusF32-2,主要抑菌產物為蛋白類物質。將其作為輔助發酵劑用于酸奶發酵,對酸奶的發酵時間、感官品質、活菌總數均無負面影響,且在酸奶貯藏后期,能有效改善酸奶后酸化現象,在酸奶體系中能有效抑制霉菌和酵母菌的生長,延長酸奶的貨架期，具有酸奶輔助發酵劑和保鮮菌的開發前景。