基于網絡藥理學及其分子對接分析雞血藤在子宮內膜異位癥中的作用機制

龐俏燕，蔣姍珊，王亞靜，邵昱瑋，游琛，張亞萍

(1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530001；3.廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西 南寧 530001)

0 引言

子宮內膜異位癥(EMs)簡稱內異癥，是原本生長在子宮體的內膜組織，即腺體和間質在子宮體以外的組織部位出現。其常見的臨床癥狀主要進行性加重的痛經、盆腔粘連以及不孕，這些不適癥狀不僅大大降低了婦女的生活質量及工作效率[1]，而且影響心理健康[2]。內異癥雖然屬于良性的疾病，惡變的發生幾率很小，但具備了惡性腫瘤的種植、侵襲以及遠處轉移的特征，它發病率大約為10%-15%，近年來也呈現出逐漸上升的趨勢。西醫治療主要有服用性激素的假孕療法和假絕經療法，或者是手術配合藥物治療，但經治療后的復發率仍相當高，這是至今治療的難點。現越來越多的臨床數據表明，傳統中醫的干預治療可以明顯減輕疼痛，增加受孕，減少復發[3-5]。隨著中藥的基礎研究不斷深入，中藥分子生物學機制可以為我們的治療提供新思路。

雞血藤的功用有活血補血、調經止痛、舒經活絡，在現代藥理研究中，其具有改善造血系統、保護心血管系統、抗腫瘤、抗氧化、雙向調節絡氨酸、消炎抗菌、鎮痛和鎮靜催眠等作用[6-8]，臨床廣泛運用于血液及心血管疾病中的貧血、骨髓抑制、風濕性心臟病等；用于神經系統的各種疾病，如中風后半身疼痛、面神經炎；在許多婦科疾病中更是很好的被運用，如月經不調、子宮內膜異位癥等[9]。有文獻表明，雞血藤干預子宮內膜異位癥具有顯著作用[10]，但目前內異癥潛在的作用靶點如何被雞血藤的有效成分干預的研究空白，分子作用機制不明。為了解雞血藤干預內異癥的作用機制，本文運用網絡藥理學的方法，分析雞血藤有效成分治療EMs 潛在機制，為雞血藤治療EMs提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 雞血藤有效成分篩選及靶點基因的預測

運用TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索雞血藤的有效成分，以藥物相似性DL> 0.18及口服生物利用度OB (%)>30作為檢索的依據收集符合條件的有效成分，并在平臺中“Targets information”收集此有效成分的靶蛋白名稱，然后運用Perl軟件對收集到的有效成分及其靶蛋白進行規范化處理，獲得相對應的靶基因的全名和具有基因編碼的靶基因。

1.2 EMs相關靶點基因的收集

檢索雞血藤的系列靶點，把“endometriosis”作為檢索的一個關鍵詞，在GeneCards (https://www.genecards.org/)和OMI數據庫(https://www.omim.org/)分別下載相對應的該疾病的靶基因，并將這兩部分的靶基因合并在一起。

1.3 網絡合并

使用R語言對藥物基因靶點與疾病基因靶點取交集，采用VennDiagram包繪制韋恩圖，并將雞血藤的相關靶點與EMs的相關靶點交集關聯，得到雞血藤干預EMs的重要靶點，采用Cytoscape 3.7.2軟件將以上成分進行可視化分析。

1.4 蛋白互作網絡的構建

為了解靶點所表達的蛋白相互作用的信息，確定核心靶基因，把雞血藤干預EMs的相關靶點基因上傳至STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)平臺構建PPI網絡圖。再利用R語言軟件根據節點之間的關系程度選出PPI網絡中前20位靶基因，以更好解地了雞血藤通過靶基因作用治療EMs。

1.5 GO分析和KEGG通路分析

采用基因本體論(GO)和通路富集來分析靶基因，利用Bioconductor 中的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”三個包對靶基因進行GO和 KEGG富集分析，得到GO和KEGG的富集圖及氣泡圖。

1.6 分子對接

通過pubchem網站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索獲取化合物的SDF結構文件，從 Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 數據庫中檢索獲得七個受體蛋白，利用PYMOL 2.3.4軟件對這些受體蛋白進行去水、去配體等操作，再采用AutoDockTools軟件對這幾個受體蛋白進行加氫、平衡電荷等修飾，利用AutoDock Vina 1.1.2對這七個受體蛋白與五個配體小分子分別進行分子對接。

2 結果

2.1 雞血藤的重要活性成分的篩選

通過閾值設定OB≥30%，DL≥0.18，在TCMSP平臺上共收集雞血藤的24活性化合物作為主要的有效成分，并對各預測的活性成分進行編號(MOL ID)。雞血藤的主要化學成分基本信息見表1。

表1 雞血藤的主要有效成分

2.2 雞血藤和EMs的基因靶點預測

采用TCMSP數據庫檢索出雞血藤成分的基因靶點(Gene Target)428個，并采用Uniprot數據庫據中藥成分的靶點檢索到相應的人類的已知基因靶點(Gene Symbol)，排除未找到的，共獲取175個基因靶點Gene Symbol)，去除重復的119個重復發靶點，獲得雞血藤對應的靶點基因56個。采用Gene Cards (https://www.genecards.org/)及OMIM (https://www.genecards.org/)數據庫檢索與EMs對應的基因1446個。

2.3 網絡合并

利用R語言軟件“VennDiagram”將1446個EMs對應的基因與56個雞血藤作用的靶點做交集，共獲得35個靶點基因，繪制韋恩圖(圖1)。采用Cytoscape3.7.2軟件將雞血藤24個有效成分和35個靶基因組合構建“成分-靶點-疾病”交互網絡結構圖，如圖2所示，紅色菱形代表EMs疾病，與之相連的綠色橢圓形代表35個靶基因，藍色長方形代表24個有效成分。最后通過拓撲學分析發現木犀草素(luteolin)、甘草查爾酮(licochalcone a)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、8-鄰甲基雷公藤(8-o-Methylreyusi)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等8個有效成分發揮主要作用，見表2。

圖1 EMs相關基因與雞血藤作用靶點的交集

圖2 雞血藤作用于EMs的有效成分-靶基因的關系

表2 關系網絡中有效成分節點的拓撲學分析

2.4 PPI網絡的構建

利用STRING數據庫，構建雞血藤治療EMs相關靶點的PPI網絡網絡圖(圖3)，共發現34個節點，263條相互作用關系，每一個節點代表一個靶基因，每條邊則代表兩個的靶基因之間的關系，線條越多則表示之間的關聯的越大(圖4)，其中關聯度較大的有靶基因有MYC、CCND1、EGFR、ESR1、VEGFA、CASP3、IL6，這些靶基因可能為雞血藤治療EMs的重要作用靶點。

圖3 靶基因的PPI網絡

圖4 關系較為密切的前20靶基因

2.5 GO富集分析

通過Bioconductor對靶基因進行GO和KEGG富集分析，發現靶基因的GO主要涉及DNA集合轉錄因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子、激素受體等(圖5)；KEGG 信號通路主要富集在前列腺癌、人巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等(圖6)，通路中較為重要的是PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Estrogen signaling pathway、JAK-STAT signaling pathway等(表3)。

圖5 GO富集分析氣泡圖

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

表3 靶基因的重要通路

2.6 潛在活性成分-靶蛋白分子對接

AutoDock Vina將結果以一種親和能(Affinity)的形式輸出，通過計算受體-配體復合物的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評估其親和力，最終給出親和能打分，這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結合的重要指標，是AutoDock Vina軟件的核心參數，能值越低，二者的結合效果越好。一般認為結合性較好的標準為：能值≤-5.0kcal/mol。根據對接的結果(表四)，雞血藤中的5種核心活性成分與MYC、CCND1、EGFR、ESR1、VEGFA、CASP3、IL6的分子對接結合能均小于-5.0 kcal/mol，表明雞血藤的中藥活性成分與靶點蛋白之間具有良好的結合能力。

表4 潛在活性成分-靶蛋白分子對接

3 討論

子宮內膜異位癥依據患者最主要的不適癥狀，在祖國醫學上的病名曰“痛經、癥瘕、不孕”等。劉曉杰[11]參考31篇關于內異癥的中醫藥研究進展，總結其它的病因病機為氣滯血瘀、氣虛血瘀、腎虛血瘀、熱灼血瘀、寒凝血瘀、痰濕血瘀，由此可知內異癥的總病機為血瘀，在中醫治則中也始終貫穿活血化瘀的治法。在中藥理論中，配伍不當或長久用活血化瘀大必然耗傷正氣，而雞血藤作為活血化瘀的常用藥，善入血份，其特點在于活血不留瘀，祛瘀而不傷正，是治療婦科疾病的要藥[12-13]。如國醫大師班秀文善用雞血藤治療婦女的痛經、癥瘕、不孕等婦科病癥。雞血藤在現代藥理學中的一個作用為抗腫瘤，而內異癥在臨床行為學上具有種植、侵襲、轉移的惡性腫瘤的特點，雞血藤可能在治療內異癥發揮抗腫瘤的作用，但這待進一步的研究。

3.1 子宮內膜異位癥與靶基因探討

子宮內膜異位癥的發病機制目前還沒有完全明確的定論，現在普遍支持的是“經血逆流學說”，隨著經血逆流的子宮內膜碎片進入腹膜發展成子宮內膜異位癥必須避免免疫清除，附著于腹膜上皮，侵入上皮，建立局部神經血管以持續生長和存活，而完成在此機制中涉及激素調節、細胞凋亡、血管生成及炎癥反應[14]。在PPI網絡的關聯度較大的靶基因中，C-myc是雌激素的靶基因，參與細胞的調控，MYC的上調與EMs的發生有關[15-16]。CCND1亦可能參與細胞的調控，阿艷妮[17]通過檢測40例卵巢子宮內膜異位囊腫患者的CCND1，陽性率高達72.50%，結果顯示該疾病的發生與CCND1可能存在一定關系，病因可能為CCND1的過度表達使細胞的增殖異常，促使子宮內膜在子宮體以外殖、種植、侵襲和破壞。CASP3是細胞細胞凋亡的關鍵蛋白酶，有研究表明CASP3可能是EMs嚴重程度的可靠預測指標[18]。子宮內膜異位植入物需要新血管形成才能擴散并侵入宿主內的異位部位，VEGFA是血管內皮生長因子，其已成為EMs的關鍵血管生成調節劑[19]。異位病灶局部的高雌激素與雌激素受體結合使組織細胞的增殖、黏附、凋亡等方面異常，加快了內異癥的形成[20]。有研究表明，EMs患者腹膜液中白介素(IL)-6的濃度升高，腹膜液中IL-6R的增加通過增強IL-6的生物活性而促進子宮內膜異位癥的發展[21]。通過上述分析的靶基因，發現這些重要的靶基因與細胞凋亡、雌激素、血管生成、炎癥反應等的關系緊密，這和EMs的發病機制相符合。

3.2 KEGG通路探討

分析雞血藤治療子宮內膜異位癥的通路，PI3K-Akt和MAPK信號通路影響EMs的黏附、侵襲、血管生成、細胞凋亡，并受激素水平調控[22]，雞血藤可能通過調控這兩條通路的過度激活控制MEs的發展。TNF-α是炎癥因子，可作為診斷子宮內膜異位并發不育癥的重要參考指標[23]，雞血藤可能通過調節TNF信號通路，減少TNF -α對子宮內膜產生的炎癥反應而達到治療的效果。HIF-1α是缺氧誘導因子，其和VEGF在EMs患者增生期內膜組織中的表達呈正相關，均可促進子宮內膜異位癥血管的生成[24]，雞血藤可能通過抑HIF-1 信號通路和VEGF信號通路的高表達而控制EMs的發展進程。AK-STAT信號通路可直接參加EMs的發生發展[25]，雞血藤可能通過此通路抑制新生血管的形成從而阻斷EMs的發展。通過上述通路的分析，雞血藤干預子宮內膜異位癥涉及調節激素分泌、控制炎癥反應、抑制細胞及血管生成的通路。

本研究采用網絡藥理學方法分析雞血藤對子宮內膜異位癥的作用機制，為研究雞血藤有效成分對EMs的作用提供理論依據。然而，本文僅是利用在線數據庫篩選雞血藤有效成分作用于EMs的靶基因、通路，但仍需通過實驗研究加以驗證。