基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃輔治急性胰腺炎的作用機(jī)制

余涵

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000)

0 引言

急性胰腺炎是臨床常見(jiàn)的消化內(nèi)科疾病，主要是胰酶被激活后引起胰腺組織自身消化而導(dǎo)致癥反應(yīng)[1]。臨床以急性上腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱和血胰酶增高等為特點(diǎn)。病變程度輕重不等，臨床病理常把急性胰腺炎分為輕度急性胰腺炎、中度急性胰腺炎及重度急性胰腺炎。臨床上，大多數(shù)患者的病程呈自限性，20%～30%患者臨床經(jīng)過(guò)兇險(xiǎn)，總體病死率5%～10%。中國(guó)急性胰腺炎診治指南2019年版指出MAP的治療以禁食、抑酸、抑酶及補(bǔ)液治療為主，補(bǔ)液只要補(bǔ)充每天的生理需要量即可，一般不需要進(jìn)行腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)[2]。對(duì)于MSAP及SAP需要采取器官功能維護(hù)、應(yīng)用抑制胰腺外分泌和胰酶的抑制劑、早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、合理使用抗菌藥物、處理局部及全身并發(fā)癥、鎮(zhèn)痛等措施。中醫(yī)多以癥狀命名，故急性胰腺炎無(wú)中醫(yī)專(zhuān)屬名稱(chēng)[3]。根據(jù)古人對(duì)胰腺及類(lèi)似急性胰腺炎癥狀的描述，現(xiàn)在人們多把急性胰腺炎歸為“腹痛”“脾心痛”“脾實(shí)”和“結(jié)胸”來(lái)進(jìn)行研究。中醫(yī)認(rèn)為感受六淫之邪、飲食不潔(醇酒肥甘)、情志不舒、膽石、蟲(chóng)積、創(chuàng)傷等因素是急性胰腺炎的主要病因，基本病機(jī)為氣、濕、熱結(jié)聚不散則釀生熱毒，熱毒熾盛又易致血熱妄行而致血瘀，熱毒血瘀互結(jié)，腑氣不通[4]。中醫(yī)藥治療急性胰腺炎途徑多，可以有效減少?gòu)?fù)發(fā)，副作用相對(duì)較小[5]。

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.>唐古特大黃 Rheu tanguticum Maxim.exBalf. 或藥用植物大黃 Rheum officinale Baill. 的干燥根或根莖。性味歸經(jīng)：苦，寒，歸脾胃、大腸、肝、心包經(jīng)。功效：瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃內(nèi)含番瀉苷A、大黃酸蒽酮苷和大黃酸蒽酮等多種成分[7]。Wan B等[8]提出番瀉苷A具有刺激腸蠕動(dòng)、促進(jìn)腸液分泌、增強(qiáng)腸張力、軟化大便、改善腸麻痹、促進(jìn)排氣、排便的作用；Yao P等[9]認(rèn)為大黃通過(guò)松弛oddi括約肌達(dá)到促進(jìn)胰液及膽汁的排泄功能，可有效緩解患者腹痛、腹脹，縮短血清淀粉酶恢復(fù)時(shí)間。大黃酸蒽酮苷和大黃酸蒽酮可在小腸吸收，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化作用于骨盆神經(jīng)叢和黏膜神經(jīng)叢，使腸蠕動(dòng)增加，進(jìn)而達(dá)到導(dǎo)瀉、減少腸道內(nèi)細(xì)菌移位、下調(diào)炎癥相關(guān)因子表達(dá)的功效[10]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可結(jié)合海量數(shù)據(jù)庫(kù)[11](DrugBank、STITCH、ChEMBL、OMIM、KEGG、TCMID、TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù))可研究藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，可通過(guò)整合中藥化學(xué)成分、疾病靶標(biāo)構(gòu)建“化學(xué)成分-作用靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)”[12]。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究，既反應(yīng)了大數(shù)時(shí)代生物醫(yī)藥系統(tǒng)性研究的新趨勢(shì)，又適應(yīng)了中醫(yī)藥對(duì)系統(tǒng)性研究方法的需求，且能很好地與我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥結(jié)合而體現(xiàn)其原創(chuàng)性[13]。在此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃輔治AP的作用機(jī)制，為今后中藥治療AP提供思路和方向。

1 資料與方法

1.1 藥物中活性成分及藥物靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/)，檢 索 大 黃 的 化 學(xué) 成分，通過(guò)口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)及類(lèi)藥性(Drug-likeness，DL)的篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)進(jìn)行篩選。篩選出符合條件的化學(xué)成分作為活性成分并得到相關(guān)靶點(diǎn)，借助疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)(Universal protein，UniProt)(https://www.uniprot.org/)查詢(xún)相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名。

1.2 藥物活性成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將大黃的活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)，上傳至網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape (V3.7.1)(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的檢索及活性成分-疾病共有靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)Genecard 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)以“Acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞檢索目前已報(bào)道的與急性胰腺炎相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將“1.1”項(xiàng)中活性成分靶點(diǎn)基因與“1.3”中疾病靶點(diǎn)基因分別輸入韋恩圖網(wǎng)站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)，得到的重合靶點(diǎn)即為“大黃”治療急性胰腺炎的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI)的構(gòu)建

將篩選得到的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設(shè)置為“Home sapiens”，最小互作分?jǐn)?shù)值為0.4，其余參數(shù)保持不變，得到PPI相互作用關(guān)系圖，保存其TSV格式文件。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

將共同靶標(biāo)同時(shí)導(dǎo)入Metascape生物分子功能注釋系統(tǒng)(www.metascape.org/)進(jìn)行GO基因本體功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置P Value Cutoff為0.01，選擇生物過(guò)程(Biological Processes)、分子功能(Molecular Functions)、細(xì)胞組成(Cellular Components)、KEGG通路(KEGG Pathway)進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

由TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“大黃”，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為檢索條件并進(jìn)行篩選后，得到的大黃活性成分為16個(gè)，見(jiàn)表1。將這16個(gè)活性成分經(jīng)由TCMSP查詢(xún)成分相關(guān)靶點(diǎn)，去重后共得到62個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)相關(guān)靶點(diǎn)的基因名。

2.2 藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的16個(gè)活性成分及62個(gè)相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)關(guān)系保存為EXCEL文件，通過(guò)可視化軟件Cytoscape3.7.1構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，得到“大黃”的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，共得到78個(gè)節(jié)點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 “大黃”活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點(diǎn)的檢索及活性成分-疾病共有靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Acute pancreatitis”，得到922個(gè)急性胰腺炎相關(guān)的基因。將活性成分靶點(diǎn)基因與急性胰腺炎相關(guān)基因通過(guò)韋恩圖得到兩者交集，共有靶點(diǎn)為21個(gè)，即為“大黃”治療急性胰腺炎的潛在靶點(diǎn)。韋恩圖如圖2。

圖2 韋恩圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將“大黃”治療急性胰腺炎21個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系圖，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件圖構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3)，其中共有21個(gè)節(jié)點(diǎn)和90條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值8.57，經(jīng)過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選出11個(gè)核心靶點(diǎn)，包括環(huán)加氧酶2(PTGS2)、腫瘤壞死因子(TNF)、周期素依賴(lài)性激酶抑制因子1B (CDKN1B)、CHEK1等，提示以上靶點(diǎn)是大黃治療急性胰腺炎的核心靶點(diǎn)，如圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO富集分析

2.5 通路富集分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中得到了GO分析14個(gè)富集條目，主要涉及生物過(guò)程(Biological Processes)7個(gè)，如積極調(diào)控細(xì)胞死亡(positive regulation of cell death)、神經(jīng)元死亡的積極調(diào)控(positive regulation of neuron death)、DNA損傷反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction in response to DNA damage)、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖(regulation of vascular smooth muscle cell proliferation)等，分子功能(Molecular Functions)5個(gè)，如半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號(hào)通路(cysteinetype endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性(cyclin-dependent protein serine/threonine kinase inhibitor activity)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)等，細(xì)胞組成(Cellular Components)2個(gè)，膜筏(membrane raft)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(transferase complex)。大黃治療急性胰腺炎的核心靶點(diǎn)GO富集分析如圖，從上至下分別為BP、MF、CC。

由KEGG富集分析結(jié)果可知，大黃治療急性胰腺炎的核心基因富集的通路有9條，主要通路涉及乙型肝炎通路、癌癥途徑通路、P53信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗通路及癌癥中蛋白聚糖通路等，見(jiàn)圖5。

圖5 KEGG富集分析

3 討論與結(jié)論

Peery AF等[14]人在2015年發(fā)表的文章指出，在美國(guó)，AP在因消化病而收入院的患者中排名第3。每年有超過(guò)275000例患者因AP收入院，其中超過(guò)2000例死亡，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)26億美元。在過(guò)去30年中，AP發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)，但發(fā)病率的上升可能與影像診斷技術(shù)的提高有一定關(guān)系[15]。AP發(fā)病的病因主要為以膽源性為主，其次是酒精和高脂血癥。AP的總體死亡率較低，不到1%，但SAP死亡率較輕癥明顯上升，18%～40%不等，高齡是AP病人死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原文中如此記載“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”[16]。有學(xué)者指出急性胰腺炎多屬于氣機(jī)不暢，實(shí)熱壅結(jié)的里熱實(shí)證，根據(jù)“六腑以通為用”的原則，治療多以清里攻下法，大黃兼有清熱、逐淤、瀉下功能，故能以此治療急性胰腺炎。

本研究通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的OB和DL篩選出大黃16個(gè)活性成分，對(duì)應(yīng)21個(gè)AP靶點(diǎn)，通過(guò)富集分析得到9條信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示大黃可能通過(guò)PTGS2、TNF、CDKN1B、CHEK1等靶點(diǎn)發(fā)揮治療AP的作用。由KEGG富集分析可知，核心靶點(diǎn)主要調(diào)控p53信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，p53通路涉及腫瘤抑制，調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，包括細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)抑制、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、分化和加速DNA修復(fù)，基因毒性和細(xì)胞應(yīng)激后的衰老等重要的生物進(jìn)程，p53可促進(jìn)Bax、抑制Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而激活p53信號(hào)通路可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞應(yīng)激后的衰老[17]。IL-17可以直接或間接誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白來(lái)識(shí)別介導(dǎo)自身免疫和慢性感染的靶基因IL-17可以直接或間接誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白來(lái)識(shí)別介導(dǎo)自身免疫和慢性感染的靶基因。IL-17可以被認(rèn)為與機(jī)體的多種炎癥反應(yīng)相關(guān)，Kondo S[18]研究指出IL-17是急性胰腺炎病情加重的關(guān)鍵機(jī)制之一。因此通過(guò)抑制IL-17信號(hào)通路進(jìn)而減少AP進(jìn)展中的炎性因子表達(dá)。

綜上，中藥及其復(fù)方具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。近10年來(lái)，隨著現(xiàn)代基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等“組學(xué)”理論的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)視角的引入以及生物信息學(xué)的應(yīng)用[19]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)概念應(yīng)運(yùn)而生，它是在系統(tǒng)生物學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)綜合地觀(guān)察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘[20]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究大黃治療急性胰腺炎的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制，望對(duì)未來(lái)臨床運(yùn)用大黃治療急性胰腺炎有一定的指導(dǎo)作用[21]。