原發性膽汁性膽管炎動物模型的研究進展

徐雅菲， 趙志斌， 廉哲雄

1 華南理工大學 醫學院， 廣州 510006； 2 廣東省人民醫院， 廣州 510000

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是一種由免疫系統對肝內中小膽管上皮細胞特異性攻擊引起的自身免疫性肝病，多發于中老年女性，其發病原因和機制尚不清楚。通常患者血清學特征包括高滴度的抗線粒體抗體(AMA)，高水平的ALT、ALP和高水平的促炎性細胞因子，如IFNγ、TNFα等。肝臟組織學特征包括門靜脈區淋巴細胞浸潤，早期的膽管周圍肉芽腫形成、肝門靜脈區嗜酸性粒細胞浸潤和選擇性中小膽管破壞(也稱為非化膿性破壞性膽管炎)，晚期可發展為纖維化，最終可能進展為肝硬化甚至肝癌，但病情嚴重程度和時間進展在患者之間差異很大[1]。其中AMA是PBC高度疾病特異性的血清指標，90%～95%的PBC患者可測到AMA陽性，對于PBC的診斷有非常重要的意義，然而AMA滴度與PBC疾病嚴重程度無關，其在PBC疾病發展中的作用尚不清楚[2]。為了加深對PBC疾病本身的認識，同時幫助臨床醫師在探究PBC疾病機制和尋找新療法的研究中更科學、合理地選擇工具，本文討論了多種PBC動物模型的建模原理和疾病特征。

1 基因編輯小鼠

基因編輯小鼠通過基因編輯技術對特定目標基因進行修飾，引起免疫調節缺陷，使其自發產生類似于PBC的自身免疫反應，常用的基因編輯PBC小鼠模型研究進展如下。

1.1 TGFβ Ⅱ型受體(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type Ⅱ, dnTGFβRⅡ)小鼠 dnTGFβRⅡ小鼠在CD4啟動子的控制下，過表達顯性失活dnTGFβRⅡ，通過干擾TGFβ和TGFβ Ⅰ、Ⅱ型受體組成的功能信號復合體的組裝，特異地阻斷T淋巴細胞中的TGFβ信號通路[3]。

該模型模擬了人類PBC疾病早期的關鍵臨床特征，在PBC免疫學發病機制研究中得到廣泛應用。血清學上，dnTGFβRⅡ小鼠自發產生AMA。22～24周齡時，分別有100%、95%和68%的小鼠血清顯示抗PDC-E2、OGDC-E2和BCOADC-E2抗體陽性。組織病理學上，肝臟門靜脈區有中度至重度淋巴細胞浸潤，主要為CD4+和CD8+T淋巴細胞，也可見B淋巴細胞、NK細胞、單核/巨噬細胞，并且其浸潤程度與膽道破壞相關。此外，小鼠血清中IFNγ、TNFα、IL-6和IL-12p40水平升高，這也與人類PBC血清細胞因子譜相似。進一步過繼轉輸實驗結果提示，CD8+T淋巴細胞是導致dnTGFβRⅡ小鼠PBC樣癥狀的關鍵效應細胞，而CD4+T淋巴細胞主要與小鼠并發的結腸炎相關[3]。

最新的研究[4]表明，雌性dnTGFβRⅡ小鼠肝臟中出現更嚴重的淋巴細胞浸潤，具有更高水平的炎癥因子。該小鼠模型的缺點是門靜脈區未見明顯的嗜酸性粒細胞浸潤和肉芽腫[5]。另外，小鼠模型中未見循環IgM的持續升高，而是出現IgA水平升高[3]。該小鼠主要的并發癥是3～4月齡出現嚴重的炎癥性腸病，其胃、十二指腸、胰腺和腎臟中也觀察到輕度單個核細胞浸潤[3]。

1.2 腺嘌呤尿嘧啶富集元件(adenylate uridylate-rich element, ARE)-Del-/-小鼠 ARE-Del-/-小鼠，通過缺失IFNγ基因3′端非翻譯區的ARE而導致IFNγ的慢性持續表達[6]。

ARE-Del-/-小鼠發病具有明顯的性別傾向性，雌性不僅發病率高于雄性，且疾病嚴重程度更高。雌性8～10周齡的ARE-Del-/-小鼠血清中可檢測到高滴度的抗PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的AMA；相比之下，8～10周齡的雄性小鼠僅可檢測到抗PDC-E2抗體，并且隨年齡增長而消退，在20周齡時3個表位的AMA均不能檢測到。肝臟病變方面，20周齡的雌性小鼠顯示有中度至重度的門靜脈淋巴細胞浸潤，而雄性小鼠僅有輕度至中度浸潤。此外，雌性小鼠的門靜脈和小葉炎癥、小膽管破壞和肉芽腫形成更為嚴重，部分可見輕度纖維化，而在雄性小鼠中纖維化程度較低或檢測不到。20周齡的雌性ARE-Del-/-小鼠總膽汁酸上調，其AST和ALT水平均顯著升高。促炎細胞因子方面，雌性小鼠血清中IFNγ和TNFα水平也更高。此外，過繼轉輸實驗表明CD4+T淋巴細胞是導致肝門靜脈炎癥的主要致病細胞[7]。

肝臟RNA測序顯示，雌性小鼠比雄性更富集1型和2型IFN信號及淋巴細胞介導的免疫反應相關基因，這可能是ARE-Del-/-小鼠表現出雌性傾向的原因[7]。該模型與臨床PBC不同的是檢測不到ALP，且肝纖維化程度較輕。由于ARE-Del-/-小鼠在4個月大時產生抗DNA抗體并表現出腎小球腎炎的特征，它也被作為系統性紅斑狼瘡的動物模型[6]。

1.3 NOD.c3c4小鼠 NOD.c3c4小鼠是非肥胖型糖尿病(non obesity diabetic, NOD)模型的同源小鼠，在3號和4號染色體上插入B6/B10品系來源的胰島素依賴性糖尿病抗性等位基因[8]。

NOD.c3c4小鼠在9～10周齡時，有56%自發產生抗PDC-E2的自身抗體，但隨著年齡的增長AMA水平下降。值得注意的是，部分小鼠抗PDC-E2自身抗體呈陰性，但可見明顯的組織學性自身免疫性膽道疾病。病理上，膽道上皮細胞受累區域有CD4+、CD8+T淋巴細胞和pDCA1+樹突狀細胞等浸潤，可見破壞性膽管炎。部分小鼠還顯示出其他與人類PBC類似的癥狀，包括嗜酸性粒細胞浸潤、上皮樣肉芽腫樣病變和早期肝纖維化。該小鼠的CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞單獨均可以致病，說明T淋巴細胞在疾病過程中的關鍵作用[8]。

該模型最大的缺點是自身免疫的初始攻擊位置與臨床不同。臨床上PBC發病起于免疫系統對肝內中小膽管的攻擊，而NOD.c3c4小鼠的初始損傷是由發生在膽總管界面的免疫反應引起的。隨著疾病的進展，NOD.c3c4小鼠的病理從膽總管擴散到肝內膽管，并表現出膽總管炎癥擴張和囊性病變。20～30周齡的NOD.c3c4小鼠中發現明顯的肝臟膽道多囊病[8]。另外，該模型檢測不到ALP，血清中IgM和IgA均升高，AMA發生率較低等原因限制了NOD.c3c4小鼠在研究中的應用。

1.4 Scurfy小鼠 Scurfy小鼠由于Foxp3基因突變引起Foxp3蛋白的缺失，導致Foxp3+Treg細胞完全消失，從而打破肝臟免疫耐受[9]。

3～4周齡的Scurfy小鼠血清均可檢測到高滴度的IgG、IgA和IgM型抗PDC-E2自身抗體。此外，小鼠肝實質和大部分肝門靜脈區域都有中度到重度的淋巴細胞浸潤，且與膽管損傷密切相關。該小鼠肝臟部分匯管區的膽管消失，在肝實質中觀察到不同程度的炎癥壞死變化，并可見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤。小葉間膽管被炎性細胞包圍，并呈退行性改變。該小鼠模型膽管損傷主要由CD8+T淋巴細胞介導[9]。另外，Scurfy小鼠血清中炎癥因子TNFα、IFNγ、IL-6、IL-12p40和IL-18水平顯著升高[10]。

Scurfy小鼠的局限性是免疫耐受打破嚴重，自發全身性的自身免疫性疾病，且壽命只有4周左右，不利于對PBC發病過程及進展機制的探究[10]。

1.5 IL-2Rα (CD25)-/-小鼠 IL-2Rα/CD25可以轉導淋巴細胞增殖的信號，并且是Treg細胞增殖、發育和活化的關鍵因子[11]。

IL-2Rα-/-小鼠血清均可檢測到IgG和IgA型的抗PDC-E2自身抗體。血清中細胞因子IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12p40水平升高[12]。病理上，肝門靜脈區有中度淋巴細胞浸潤，導致膽管破壞。其浸潤淋巴細胞主要是CD4+和CD8+T淋巴細胞，CD8+T淋巴細胞占優勢并從門靜脈區進入肝實質區域。此外，IL-2Rα-/-小鼠肝臟還有輕度界面肝炎，肝小葉可見少量CD4+或CD8+T淋巴細胞，少數情況下中央靜脈附近有明顯浸潤。

IL-2Rα-/-小鼠肝臟病理與人類PBC不同的是，沒有肉芽腫或嗜酸性粒細胞浸潤[12]。與缺乏IL-2R其他成分的小鼠一樣，該小鼠模型會發生嚴重貧血、淋巴組織增生性自身免疫性疾病和潰瘍性結腸炎樣疾病[13]，然而與人類結腸炎相關的肝膽疾病是原發性硬化性膽管炎(PSC)，而不是PBC。在IL-2Rα-/-小鼠模型中，CD4+T淋巴細胞的缺失可抑制其結腸炎癥，而CD8+T淋巴細胞的缺失可減輕其膽管損傷和肝門靜脈炎癥[13]。在8～20周齡，大約25%的IL-2Rα-/-小鼠因重度貧血死亡[12]。

1.6 IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠 IL-12p40可調節許多T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病[14]，而IL-2Rα-/-小鼠模型中觀察到血清IL-12p40水平升高[12]。在IL-2Rα-/-小鼠的基礎上敲除IL-12p40發現IL-12p40發揮雙重作用：IL-12p40的缺失一方面抑制了IL-2Rα-/-模型并發的結腸炎，另一方面加重了自身免疫性膽管炎，并促進其向肝纖維化發展，由此形成一個新的PBC小鼠模型[15]。

IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠表現出比IL-2Rα-/-模型更嚴重的肝門靜脈炎癥和膽管損傷，肝門靜脈區浸潤大量CD4+和CD8+T淋巴細胞，部分小鼠出現門靜脈高壓和肝纖維化。ALT水平顯著高于IL-2Rα-/-模型鼠。并且IL-12p40的缺失導致IFNγ反應增強，肝臟中TNFα也上調[15]。此外，部分小鼠發生脾腫大[15]，而在PBC患者中，發生門靜脈高壓癥的患者存在脾腫大現象[16]。相比于IL-2Rα-/-模型，IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠肝臟浸潤的T淋巴細胞中CD4+T、CD8+T淋巴細胞都增多，其中CD8+T淋巴細胞的效應記憶性細胞亞群比例增加[15]。CD4抗體治療和CD4缺陷的IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠PBC樣癥狀無緩解，而CD8抗體治療和CD8缺陷的IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠肝臟炎癥被抑制，說明CD8+T淋巴細胞是該模型鼠的主要致病細胞[17]。”

與人類PBC常見的情況相似，IL-2Rα-/-IL12-p40-/-小鼠并發干燥綜合征[17]。干燥綜合征是一種以眼睛、口腔和其他黏膜組織過度干燥為特征的自身免疫性疾病。這兩種疾病都由過度活化的浸潤性淋巴細胞導致上皮結構嚴重損傷引起，因此被認為是具有重疊特征的自身免疫性上皮炎[18]。該模型的另一個并發癥是自身免疫性骨髓纖維化，表現出貧血和髓外造血的特征，但臨床PBC患者并沒有這樣的并發癥[19]。

15月齡的Ae2a,b-/-小鼠中80%自發地產生了抗PDC-E2的AMA，且血清IgM和IgG水平升高。6月齡的小鼠中檢測到ALP升高，15月齡時更高，隨著時間的推移，它們的免疫反應性有增加的趨勢。大約三分之一的小鼠有廣泛的肝門靜脈炎癥，但程度不一，部分在受損的小葉間膽管周圍可觀察到單個核細胞浸潤和輕度纖維化，偶爾出現嗜酸性粒細胞浸潤。嚴重病變的肝臟顯示門靜脈區有大量CD4+和CD8+T淋巴細胞，且圍繞受損的膽管分布。該模型也有脾腫大現象[23]。

2 誘導小鼠模型

誘導小鼠模型，通過打破對特異性自身抗原或抗原模擬物的耐受性，來誘導自身免疫性膽管炎。誘導效果受動物本身條件、自身抗原或抗原模擬物的性質和佐劑等變量影響。

2.1 2-辛炔酸(2OA)-BSA免疫小鼠 研究[24-26]表明AMA能和一些分子模擬物發生交叉反應，其中篩選出了2OA，它能被AMA識別為一種高活性的半抗原。2OA在自然界中不存在，但這種化合物的甲基和乙基酯廣泛應用于香水、口紅、肥皂、洗滌劑、乳霜、乳液和許多常見的食品調味料[25-27]。由此在C57BL/6小鼠上建立2-辛炔酸偶聯牛血清白蛋白(2-octynoic acid coupled to bovine serum albumin, 2OA-BSA)誘導小鼠模型[28]。

經2OA-BSA免疫8周后，100%的小鼠血清出現抗PDC-E2抗體陽性。免疫12周后，肝門靜脈中有大量的CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤，門靜脈區損傷膽管周圍常可見淋巴細胞輕度浸潤，以及與臨床PBC相似的導管減少、散在于門靜脈區和肝實質的上皮樣肉芽腫，肝實質也有小區域的輕度局灶性壞死現象。免疫4～12周的小鼠血清中均檢測到TNFα和IFNγ明顯升高。免疫小鼠肝組織中CD4+T淋巴細胞比例降低，同時CD8+T淋巴細胞比例增加，并且CD8+T淋巴細胞參與了2OA-BSA免疫小鼠膽管炎的免疫發病機制[28]。

2OA-BSA誘導小鼠模型的缺點包括檢測不到膽汁淤積酶和不能進展為肝臟纖維化[28]。此外，利用另一種對膽道疾病易感性更高的小鼠品系NOD.1101小鼠，建立2OA-BSA誘導模型，結果顯示更嚴重的PBC樣癥狀。免疫僅2周后，100%的NOD.1101小鼠血清均呈現抗PDC-E2抗體陽性。與2OA-BSA免疫的B6小鼠相比，2OA-BSA免疫的NOD.1101小鼠肝門靜脈炎癥中觀察到大量的粒細胞，與人類PBC早期肝臟的粒細胞浸潤相似[29]。

總的來說，該模型適于用來探究導致肝臟浸潤和產生AMA的PBC早期發病過程，并且疾病表型與所用的動物背景和佐劑密切相關。

2.2 2OA-poly I∶C聯合免疫小鼠 聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid, poly I∶C)是一種病毒RNA模擬物，通過TLR-3誘導IFNα免疫應答[30]。poly I∶C免疫模型誘導8周后，在小鼠肝門靜脈區觀察到明顯的單個核細胞浸潤。免疫16周后，在80%～100%的poly I∶C注射小鼠血清中檢測到AMA陽性。伴有血清ALT和ALP升高[31-32]。但poly I∶C誘導模型疾病較輕，膽管上皮細胞未見結構改變[32]，只能模擬早期的PBC癥狀。

在2OA誘導模型的基礎上，聯合使用poly I∶C免疫可以誘導更明顯的PBC樣癥狀[33]。雖然小鼠的自身抗體水平與單獨2OA-BSA免疫模型相似，但在肝臟病理上，poly I∶C聯用顯著促進了2OA免疫小鼠的疾病進展，包括淋巴細胞浸潤、肉芽腫和膽管損傷。尤其是聯合免疫小鼠在肝門靜脈區和肝實質中發現嗜酸性粒細胞浸潤，部分小鼠出現肝纖維化。此外，血清炎性細胞因子IFNγ、TNFα、IL-12p40和IL-6的水平顯著升高。在poly I∶C單獨免疫小鼠中肝臟沒有顯示明顯的CD8+T淋巴細胞浸潤，但poly I∶C聯用使2OA免疫小鼠的肝臟中聚集了更多的效應CD8+T淋巴細胞，表明poly I∶C不能單獨誘導CD8+T淋巴細胞的活化，但能誘導細胞毒性效應CD8+T淋巴細胞進入肝臟，這可能是poly I∶C促進2OA免疫小鼠PBC疾病進展的原因。另外，poly I∶C給藥導致的炎性粒細胞積累可能加重小鼠局部肝臟炎癥和2OA-BSA誘導的自身免疫性膽管炎[33]。

3 小結

PBC發病機制尚不清楚，目前一般認為這種慢性肝病是由基因和環境誘導因子共同作用導致的，并且大約三分之一的PBC患者會合并其他自身免疫性疾病[34]。目前僅有熊去氧膽酸和奧貝膽酸兩種對癥藥物，并且藥物治療只能緩解病情、減慢疾病發展速度，尚無治愈PBC的方法[35]。因此需要更深入地探究PBC的發病機制，加強對這種疾病的理解，并尋找新的治療靶點。

由于PBC早期臨床組織樣本較難獲得，基于動物模型的研究對于探究PBC的發生發展機制和開發新的治療方案顯得尤為重要。在對PBC疾病機制的探究過程中，有許多動物模型起到了重要作用。然而，迄今為止，沒有一個單一的模型完全模仿人類PBC的所有病理特征。表1列出了不同PBC模型的造模原理、優缺點、并發癥和主要致病細胞，對部分模型給出了選擇建議。了解PBC動物模型的建模原理和疾病特征，既有利于加深對PBC疾病特性的認識，也有助于研究者對研究工具的選擇。

表1 不同PBC模型特點比較

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：徐雅菲、趙志斌、廉哲雄參與起草和修改文章關鍵內容。