MTHFR基因多態性對大劑量甲氨蝶呤化療后患兒血藥濃度及藥物不良反應的影響

裴保方，陶興茹，劉 煒，郭鵬波，呂 萌，馬姝麗

(鄭州大學附屬兒童醫院 1 藥學部，2 血液腫瘤科，3 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室，鄭州 450018)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是常見的兒童白血病類型之一。大劑量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate，HD-MTX)在ALL患兒維持治療中發揮著重要的作用[1]，但在臨床治療過程中，患兒對HD-MTX的敏感性和藥物不良反應存在明顯的個體差異。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝途徑中參與催化亞甲基四氫葉酸生成甲基四氫葉酸的關鍵酶之一[2]，也是MTX發揮藥理作用的關鍵酶之一，其基因多態性可能與MTX化療后血藥濃度及藥物不良反應相關。本研究旨在探討MTHFRA1298C和MTHFRC677T基因多態性與ALL患兒HD-MTX化療后血藥濃度及藥物不良反應的關系，為MTX的合理應用及藥物不良反應預測提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月～2019年9月在本院兒童血液腫瘤科確診的ALL住院患兒77例作為研究對象。其中，男性患兒56例，女性患兒21例；最小年齡1歲4個月，最大年齡14歲，平均年齡(4.88±2.48)歲?；純阂话阗Y料無統計學差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。本研究經本院倫理委員會批準(倫理批件號:2020-K-022)。本研究為利用以往臨床診療中獲得的病例/生物標本的研究，經本院倫理委員會批準免除知情同意。

表1 患兒一般資料比較

納入標準：每例患兒的診斷均參照《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂)》[3]，所有患兒均處于鞏固治療階段。

排除標準：① 早期強化療后未完全緩解者。② 使用過程中出現嚴重過敏反應者。③ 嚴重心、肺、肝腎功能不全者。

1.2 治療方法

參照兒童ALL治療建議，甲氨蝶呤注射液(Pfizer Australia Pty Ltd,注冊證號H20140207,規格1000 mg/10 ml)給藥劑量為低危組2.0 g/m2、中高危組5.0 g/m2，總劑量的1/10作為突擊量于前0.5 h內快速靜脈滴入，余量于后23.5 h內勻速滴入。突擊量MTX滴入后2 h內，進行三聯鞘內注射：甲氨蝶呤注射液+注射用阿糖胞苷(Pfizer Italia s.r.l.，國藥準字HJ20160403，規格0.1 g)+地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業有限公司，國藥準字H12020516，規格1 ml∶2 mg)，同時給予大劑量水化、堿化治療；MTX滴注48 h后進行四氫葉酸鈣(CF)解救治療，之后根據MTX血藥濃度監測結果調整CF解救方案，直至MTX血藥濃度≤0.3 μmol/L(機器可檢測最低范圍)時停止解救。

1.3 基因分型

MTHFRA1298C和MTHFRC677T基因檢測試劑盒購自上海吉凱基因科技有限公司；血藥濃度監測采用西門子Viva-E2000全自動藥物濃度分析系統(德國德靈診斷公司)。

目的片段的引物分別是5’-CAGTCCCTGTGGTCTCTTCAT-3’和5’-CTCACCTGGATGGGAAAGAT-3’與5’-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3’和5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3’。PCR反應體系為25 μl，含有模板DNA 0.1 μg、各引物0.4 μmol/L、脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)0.2 mmol/L、MgCl 21.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶及其1×緩沖液1.0 U。反應在ABI Verity熱循環儀上進行，95 ℃預變性1 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s和72 ℃ 20 s，共35個循環，最后72 ℃延伸7 ℃，后者的退火溫度是58 ℃。

1.4 MTX血藥濃度監測

HD-MTX開始后48和72 h采患兒靜脈血2 ml，采用酶放大免疫法測定MTX血藥濃度，若48 h時MTX血藥濃度≤0.3 μmol/L，可不予測定72 h MTX血藥濃度。

1.5 藥物不良反應監測

HD-MTX化療期間，觀察記錄患兒藥物不良反應，根據美國國立癌癥研究所常規毒性判定標準4.0版(NCI-CTC 4.03)及《抗癌藥物急性及亞急性毒性反應分度標準(WHO)》[4]，對藥物不良反應進行分級，分級≥Ⅱ級被認為是臨床相關的化療不良反應。不良反應評價觀察指標有：外周血中性粒細胞減少(N<1.5×109/L)、血紅蛋白降低(Hb<95 g/L)和血小板減少(PLT<75×109/L)、胃腸道反應(暫時性嘔吐、腹瀉能耐受≥2天)、黏膜損害(口腔紅斑、潰瘍)、肝臟損害(谷丙轉氨酶≥2.5倍正常值上限)、腎臟毒性(尿素氮≥2.5倍正常值上限)等。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，不同基因型間藥物不良反應比較，計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗，用非線性logistic回歸分析計算比值比(OR)及其95%可信區間(95%CI)表明不同基因型發生不良反應的可能性。P<0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 MTHFR A1298C與ALL患兒HD-MTX化療后藥物不良反應的關系

MTHFRA1298CAA型患兒較AC+CC型發生血小板減少的風險增加了2.10倍(OR=2.10,95%CI:0.23～19.08,P<0.05)，胃腸道不良反應的發生率增高，具有統計學差異(P<0.05)，不同基因型患兒中性粒細胞減少、血紅蛋白降低、黏膜損害、肝臟損害等藥物不良反應的發生風險無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 MTHFR A1298C與HD-MTX化療后藥物不良反應的關系 n=77,n(%)

2.2 MTHFR C677T與ALL患兒HD-MTX化療后藥物不良反應的關系

與CT和TT型相比，MTHFRC677TCC型患兒血小板減少、血紅蛋白降低和黏膜損害的發生率明顯升高，具有統計學差異(P<0.05)，不同基因型患兒中性粒細胞減少、胃腸道反應和肝臟損害等藥物不良反應發生率比較無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 MTHFR C677T與HD-MTX化療后藥物不良反應的關系 n=77,n(%)

2.3 MTHFR基因多態性與48 h MTX血藥濃度的相關性

MTHFRA1298C和MTHFRC677T不同基因型與HD-MTX用藥后48 h血藥濃度無統計學相關性(P>0.05)，提示MTHFR基因多態性不影響MTX的排泄。見表4。

表4 MTHFR基因多態性與48 h MTX血藥濃度的關系 n=77,n(%)

3 討論

MTHFR是參與葉酸代謝和DNA合成的重要輔酶[5]，可催化5,10亞甲基四氫葉酸還原為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸，而后者主要使脫氧鳥嘧啶核苷酸(dUMP)甲基化為脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)，并參與DNA合成和修復[6]。MTHFRA1298C和MTHFRC677T是2個最常見的多態性位點，其多態性會導致酶活性的改變，可能會改變葉酸拮抗劑的化療反應[7]。MTHFR基因多態性與MTX用藥后血藥濃度變化及化療后藥物不良反應的關系已成為目前研究的熱點之一。

目前，關于MTHFRA1298C和C677T基因多態性與HD-MTX化療相關不良反應的關系已有報道，但結果不一。本研究結果顯示，MTHFR1298AA基因型與AC+CC基因型相比，其發生血小板減少的風險增加了2.1倍，胃腸道不良反應的發生率增高，具有統計學差異(P<0.05)，在其他藥物不良反應的發生率方面無統計學差異，這與Umerez等[8]的研究結果一致。此外，樊春艷等[9]的研究發現攜帶MTHFRA1298CAA基因型的ALL患兒發生MTX化療后胃腸道反應的風險較AC+CC基因型高4.513倍，其他基因型與MTX化療后藥物不良反應則無關聯。而Zhu等[10]薈萃分析了14項研究發現MTHFRA1298C基因多態性與兒童HD-MTX的化療后不良反應發生無統計學相關性；Tantawy等[11]研究發現MTHFRA1298C多態性對ALL患者化療毒性及生存無統計學影響。研究結果的差異可能受到聯合用藥、基因頻率、當時葉酸水平以及樣本數量的影響[12]。

本研究發現與CT和TT基因型相比，MTHFRC677TCC型患兒血小板減少、血紅蛋白降低和黏膜損害的發生率升高(P<0.05)，且未發現MTHFRC677T各基因型與中性粒細胞減少、胃腸道反應和肝臟損害等藥物不良反應發生風險有統計學關聯(P<0.05)。此研究結果與部分國內外學者的研究結果一致。Mahmoud等[13]研究發現，與MTHFRC677TCC野生型相比，MTHFRC677TTT基因型患者發生肝功能異常和黏膜損害的風險顯著增加，而MTHFRC677TCT+TT型基因患兒發生血小板減少的風險同樣增加。另外，高珊等[14]研究顯示攜帶MTHFRC677TTT基因型的患兒發生MTX藥物不良反應的風險比CC野生型攜帶者更高。然而，陳先睿等[15]的Meta分析結果顯示，MTHFRC677T不同基因型患者MTX化療后藥物不良反應的發生率無統計學差異(P<0.05)；不同地區、不同人群MTHFRC677T多態性與MTX化療后藥物不良反應相關性研究的結果并不完全一致，亞葉酸鈣(CF)在一定程度上可能會降低血同型半胱氨酸水平[16]。同時，在本研究過程中,考慮到HD-MTX化療后藥物不良反應可能會受到給藥劑量、CF的解救劑量、是否充分水化、堿化等因素的影響，ALL患兒的水化、堿化方案以及CF解救方案均嚴格參照中國兒童腫瘤臨床多中心研究協作組ALL治療研究方案(CCCG-ALL-2015)，且研究入組患兒中高?；純赫?6.10%，MTX給藥劑量均按照5 g/L方案給藥，進一步排除了給藥劑量對研究結果的影響。

本研究結果提示，MTHFR基因多態性與MTX用藥后48 h血藥濃度變化無關，MTHFR基因多態性并不影響MTX的排泄。此研究結果與部分學者研究一致。王軼睿等[17]對大劑量甲氨蝶呤化療后藥物不良反應的影響因素進行了研究，結果顯示不同MTHFR基因型、性別及年齡對MTX用藥后48 h的血藥濃度變化并無統計學影響。而李靜等[18]研究了MTHFRC677T基因多態性與HD-MTX化療后ALL患兒MTX血藥濃度變化的相關性后發現，MTHFRC677T不同基因型患兒24 h血藥濃度無統計學差異，而48 h血藥濃度具有統計學差異(P<0.05)。

綜上所述，MTHFRA1298C和MTHFRC677T基因多態性與ALL患兒HD-MTX化療后藥物不良反應的發生有一定的相關性，但并不影響MTX的排泄。由此，可以在ALL患兒接受HD-MTX化療之前，通過檢測MTHFR基因型來預測MTX毒性反應，從而實現患兒個體化用藥。MTX的藥物代謝、排泄及其所致的藥物不良反應可能受到多種因素的影響，對于本研究的結果，在后續工作中還將通過擴大樣本量來進行驗證，以期為在ALL患兒HD-MTX化療過程中實現個體化用藥提供有效的依據。