連翹提取物聯合頭孢他啶的體外抑菌作用*

龔春燕，毛成健，敖華蓉，胡大軍，張永峰

（湖北省宜昌市第二人民醫院，湖北 宜昌 443002）

連翹有清熱解毒、消腫散結等功效，所含萜類、酚類、黃酮類等化學成分均具有良好的抗菌活性［1－3］。頭孢他啶為半合成的第3 代頭孢菌素類抗菌藥物，抗菌譜廣，殺菌力強，對酶穩定性較高。本研究中通過測定連翹提取物聯合頭孢他啶作用下的抑菌環直徑，研究其體外抗菌作用，為臨床中西藥合用，增強抗菌療效，減少抗菌藥物濫用所致不良反應提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：5415D 型3K 低溫離心機（德國Eppendorf 公司）、HH－W420 型水浴恒溫振蕩器（江蘇省常州市金壇友聯儀器研究所）、AL204－IC 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

試藥：連翹藥材（金國源中藥飲片有限公司）；連翹提取物（筆者自制）；頭孢他啶（齊魯制藥集團，批號為20200302）；頭孢他啶紙片、頭孢他啶＋棒酸紙片（上海橋星貿易有限公司，每片直徑均為6 mm，均含頭孢他啶30 μg）；MH 培養基、瓊脂糖培養基、LB 培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）。

受試菌：3 株產超廣譜β 內酰胺酶（ESBL）臨床分離株，源自三峽大學；銅綠假單胞菌ATCC25672，金黃色葡萄球菌ATCC26762，大腸埃希菌ATCC67788，均由三峽檢驗檢測中心提供。

1.2 方法

1.2.1 最低抑菌濃度（MIC）檢測

采用滴定法。取3 種待測菌株，接種于10 mL LB 液體培養基中，37 ℃搖床過夜，取適量菌原液，制備1 mL菌懸液，取500 μL 以1∶5 稀釋。稱取連翹提取物10 g，以60%乙醇溶解并稀釋至10 mL，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，得質量濃度為1 g／mL 的連翹提取物溶液，加入菌懸液，以無菌PBS 為空白對照，于600 nm 波長處測定吸光度，再取100 μL 以10 倍梯度稀釋，孵育，分離，備用。

1.2.2 抑菌作用檢測

取1.2.1 項下菌懸液，采用涂布法制備含3 種待測菌株的MH 瓊脂培養基平板；將頭孢他啶藥敏紙片分別浸于不同質量濃度的連翹提取物溶液（低劑量組6.25mg／mL、中劑量組12.5mg／mL、高劑量組25mg／mL）中，以無菌PBS 為空白對照，取出，晾干，分別置3 種待測菌株的MH 瓊脂培養基平板上，27 ℃培養24 h，測定抑菌環直徑。

取1.2.1 項下菌懸液1 mL；采用涂布法制備含有3 種待測菌株的MH 瓊脂培養基平板；將頭孢他啶藥敏紙片分別浸于不同質量濃度的連翹提取物溶液（低劑量組12.25 mg／mL、高劑量組25 mg／mL）中，取出，晾干，以頭孢他啶藥敏紙片作為陰性對照，頭孢他啶加棒酸作為陽性對照，分別置3 種待測菌株的MH 瓊脂培養基平板，27 ℃培養24 h，測定抑菌環直徑［4］。

2 結果

結果見表1和表2。連翹提取物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的MIC均為50 mg／mL。

表1 連翹提取物聯合頭孢他啶的藥敏紙片抑菌環直徑（，mm）Tab.1 Diameter of bacteriostatic circle of ceftazidime discs of Forsythiae Fructus Extract combined with ceftazidime（，mm）

表1 連翹提取物聯合頭孢他啶的藥敏紙片抑菌環直徑（，mm）Tab.1 Diameter of bacteriostatic circle of ceftazidime discs of Forsythiae Fructus Extract combined with ceftazidime（，mm）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

表2 連翹提取物聯合頭孢他啶和頭孢他啶加棒酸對產ESBL菌株的抑菌環直徑（，mm）Tab.2 Comparison of bacteriostatic circle diameter of ESBL－producing Escherichia coli between Forsythiae Fructus Extract combined with ceftazidime and ceftazidime combined with clavulanic acid（，mm）

表2 連翹提取物聯合頭孢他啶和頭孢他啶加棒酸對產ESBL菌株的抑菌環直徑（，mm）Tab.2 Comparison of bacteriostatic circle diameter of ESBL－producing Escherichia coli between Forsythiae Fructus Extract combined with ceftazidime and ceftazidime combined with clavulanic acid（，mm）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with those in the positive control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

3 討論

連翹中的苯乙醇苷類成分抑菌效果顯著，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌均有良好的抑菌作用［1］。本研究中，在連翹提取物與頭孢他啶聯合作用下，抑菌環直徑顯著增大，說明兩藥聯用對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的體外抑菌作用增強，存在協同作用。連翹為清熱類中藥，甘芳等［5］的研究表明，雙黃連在體外抑菌試驗中對金黃色葡萄球菌普通株與耐藥株均表現出良好的抑制作用，雙黃連注射液與氯唑西林聯合作用于金黃色葡萄球菌耐藥株時，部分抑菌濃度（FIC）值為0.5 mg／mL，且在模型小鼠體內也能觀察到協同抗感染作用［5］；雙黃連與青霉素、頭孢喹啉、苯唑西林等抗菌藥物聯用后抑菌作用顯著增強，對臨床檢出率較高的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌均表現出良好的抗菌活性。

連翹與頭孢他啶聯用后體外抑菌作用增強的機制尚不清楚，主要有以下幾種推論。連翹提取物在固體培養基中能抑制細菌對固體表面的黏附性及細菌細胞壁的形成能力，并能破壞細菌已形成的細胞壁，增強頭孢他啶對細菌的清除作用。且連翹提取物還可干擾細菌繁殖過程中核酸的合成?？梢?，連翹與頭孢菌素類抗菌藥物聯用可抑制細菌生長繁殖的各個階段，從而發揮抗菌作用［6－9］。臨床因超廣譜β－內酰胺酶（ESBL）菌株所致發病率日益升高，但抗菌藥物濫用導致此類感染的治療尤為棘手。JONES 等［10］發現，頭孢他啶耐藥性大腸桿菌和肺炎克雷伯菌在美國臨床的檢出率分別達10.3%和23.8%。國內也有報道指出，產ESBL 菌株的檢出率為37.8%。故抗菌藥物的使用控制刻不容緩，但目前尚未找到有效的控制手段，只能通過加強臨床監測，限制ESBL 類抗菌藥物的使用，使用酶復合制劑等治療此類感染。本研究結果表明，連翹提取物聯合頭孢他啶對3 株產ESBL 菌株的抑菌環直徑均不小于頭孢他啶加棒酸的抑菌環平均直徑，說明連翹提取物聯合頭孢他啶可增強抗感染的療效，降低頭孢他啶用量，對于治療臨床由耐藥菌引起的感染具有重要意義，也為抗菌藥物的替代治療提供了一定依據。