連翹酯苷對鹽水負荷模型大鼠的利尿作用*

史向華，薛潤苗，牛 丹，史 沁，續 艷△

（1.山西省藥品審評中心·山西省醫藥與生命科學研究院，山西 太原 030006；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000）

連翹是木樨科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果實，有清熱解毒、散結消腫、清心利尿功效，主治溫熱、丹毒、斑疹、癰瘍腫毒、瘰疬（淋巴結結核）、小便淋閉等證［1］，歷來有“瘡家圣藥”之稱。連翹主產于山西、河南、陜西等地，主要含苯乙醇苷類、木脂體及其苷類、五環三萜類、揮發油等化學成分。連翹酯苷屬苯乙醇苷類，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抑制彈性蛋白酶活力、解熱等作用［2－4］。本研究中探討了連翹提取物連翹酯苷對鹽水負荷模型大鼠的利尿作用，可為其臨床應用提供參考?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：CP114 型電子天平（美國Ohaus 公司）；SB－5200型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；HWS－24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；TgL－18 型高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；AC9801 型電解質分析儀（江蘇奧迪康醫學科技股份有限公司）；Cytation5 型多功能微孔讀數儀（美國BioTek 公司）；Histocentre 3 型石蠟包埋機、Finesse 325 型石蠟切片機、Excelsior 型全自動組織脫水機（英國Shandon 公司）；BX53 型熒光顯微成像系統（日本Olympus 公司）。

試藥：連翹酯苷（筆者自制，含量35.75 mg／mL）；呋塞米（上海朝暉藥業有限公司，批號為1810N13）；0.9% 氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號為2001122007）；心鈉素（ANP）、抗利尿激素（ADH）、血管緊張素轉換酶（ACE）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）的酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號均為20200525）；Na＋，K＋－ATP酶檢測試劑盒（金克?。急本旧锛夹g有限公司，批號為20200422）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20170924）。

動物：SPF 級SD 大鼠，雄性，6 周齡，體質量180～200 g。購自中國食品藥品檢定研究院，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2017－0005，實驗動物使用許可證號SYXK（晉）2017－0001。飼養于山西省醫藥與生命科學研究院藥理研究室清潔級動物房。所有大鼠置代謝籠中適應性喂養48 h 后，禁食不禁飲18 h，每只大鼠均按2.5 mL／100 g 灌胃0.9%氯化鈉注射液，使大鼠體內水平衡，排盡膀胱內余尿，收集2 h 內尿液。尿量為給水量的40%以上者為合格［5－7］。

1.2 方法

取模型大鼠40 只，隨機分為模型組，呋塞米組（0.01 g／kg），以及連翹酯苷高、中、低劑量組（1.5，0.75，0.375 g／kg），各8 只。各給藥組均按5 mL／kg 灌胃，模型組給予等體積水，每日1 次，持續8 d。末次給藥30 min 后每組均以0.9%氯化鈉溶液3 mL／100 g 灌胃，復制鹽水負荷大鼠模型。

1.3 觀察指標

累積尿量：大鼠成功建模后立即置代謝籠中，第3，6，12，24 h 分別記錄1 次尿量，并計算累積尿量。

實驗室指標：采用電解質分析儀檢測尿液中K＋，Na＋，Cl－含量。累計尿量3 h 后眼眶靜脈叢采血，分別用肝素鋰和EDTA 采血管收集，4 ℃下3 000 r／min 離心15 min，分離血漿，以ELISA 法測定ANP，ADH，ACE，AngⅡ，ALD 及Na＋，K＋－ATP 酶含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

組織病理形態學：記錄24 h 尿量后，10%水合氯醛麻醉大鼠，摘取左腎（10%中性甲醛液）固定，常規石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察大鼠腎組織結構變化。

1.4 統計學處理

2 結果

結果見表1至表3。光學顯微鏡顯示，各組大鼠腎臟組織結構完整、清晰，無異常改變，表明各劑量連翹酯苷對大鼠腎臟組織無明顯影響。詳見圖1。

表1 各組大鼠累積尿量比較（，mL，n＝8）Tab.1 Comparison of cumulative urine output of rats in each group（，mL，n＝8）

表1 各組大鼠累積尿量比較（，mL，n＝8）Tab.1 Comparison of cumulative urine output of rats in each group（，mL，n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。Note：Compared with those in the model group，*P＜0.05，**P＜0.01，as well as the following tables.

表2 各組大鼠尿液中電解質含量比較（，mmol／L，n＝8）Tab.2 Electrolyte content in the urine of rats in each group（，mmol／L，n＝8）

表2 各組大鼠尿液中電解質含量比較（，mmol／L，n＝8）Tab.2 Electrolyte content in the urine of rats in each group（，mmol／L，n＝8）

表3 各組大鼠血漿中ANP，AngⅡ，ACE和Na ＋，K ＋－ATP 酶，ADH，ALD含量比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of the levels of ANP，AngⅡ，ACE and Na ＋，K ＋－ATPase in the plasma of rats in each group（，n＝8）

表3 各組大鼠血漿中ANP，AngⅡ，ACE和Na ＋，K ＋－ATP 酶，ADH，ALD含量比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of the levels of ANP，AngⅡ，ACE and Na ＋，K ＋－ATPase in the plasma of rats in each group（，n＝8）

A.模型組 B.呋塞米組 C.連翹酯苷高劑量組 D.連翹酯苷中劑量組 E.連翹酯苷低劑量組圖1 大鼠腎組織病理切片（HE，×200）A.Model group B.Furosemide group C.Forsythoside high－dose group D.Forsythoside medium－dose group E.Forsythoside low－dose groupFig.1 The pathological section of the renal tissue of the rats（HE，×200）

3 討論

連翹利尿作用顯著［8］，但其利尿成分及作用機制尚不明確，本研究中建立鹽水負荷模型大鼠，從大鼠排尿量，尿液電解質水平，血漿中ANP，AngⅡ，ACE，ALD，ADH和Na＋，K＋－ATP 酶含量初步探討連翹酯苷的利尿作用機制。

腎素－血管緊張素－醛固酮系統（RAAS）是人體重要的體液調節系統，參與調節組織和臟器的生理和病理活動［9］，還可調節人體電解質和體液平衡，在內環境穩定方面發揮重要作用。RAAS 主要包括腎素、ACE、血管緊張素酶原和AngⅡ等。其中，ACE 還可刺激腎上腺皮質分泌ALD，ALD 進入遠曲小管和集合管上皮細胞后，加強Na＋重吸收［10－11］。本研究結果顯示，與模型組比較，中、低劑量組大鼠3，6 h 累積尿量明顯增多；高劑量連翹酯苷可明顯促進尿液中Na＋，K＋，Cl－的排出，高劑量組大鼠尿液中Na＋相比中劑量組有所減少，未造成大量Na＋流失，提示連翹酯苷利尿效果較好，且不會造成電解質紊亂。還可明顯降低AngⅡ，ACE，ALD 減少，表明其可通過調節RAAS，減少AngⅡ和ACE 的分泌，拮抗ALD 分泌，抑制腎小管重吸收，從而促進排尿。

ADH 主要作用是增加髓袢升支粗段對Na＋的重吸收，提高腎遠曲小管和集合管對水的通透性，促進水的重吸收，是影響體液平衡的關鍵性調節因素。ANP 具有抑制血管升壓素及血管緊張素、ALD、對抗腎素－血管緊張素和ADH 的作用，發揮利鈉、利尿作用［12－13］。本研究結果顯示，高、中、低劑量組大鼠ADH含量明顯減少，中劑量組大鼠ANP含量明顯增加，表明連翹酯苷可減少ADH，升高ANP，抑制腎遠曲小管和集合管對水的重吸收，促進尿液排出，而ANP 的增加又可抑制ADH和ALD 的分泌與釋放，阻礙尿液的濃縮過程，從而進一步促使大鼠尿量增多。

Na＋，K＋－ATP 酶主要參與鈉鉀細胞膜的主動轉運，為腎小管重吸收水、離子交換的主要驅動力，具有調節腎臟水和電解質平衡的功能，其活性直接影響腎小管的重吸收能力［14］。高、中劑量組該酶含量明顯減少，提示連翹酯苷可抑制該酶活性，抑制腎小管重吸收Na＋，促進水鈉排泄，同時可維持電解質平衡。

本研究中考慮利尿作用實驗劑量相對臨床常用劑量明顯提高，發現各組各指標隨著劑量的變化而改變趨勢不一致，其可能為連翹提取物以連翹酯苷為主，含有多種成分有效部位及具有雙向調節作用，隨著劑量的增大，劑量組超出了劑量效應，同時不同劑量影響藥物在體內的吸收出現負反饋，且連翹提取物的利尿作用機制尚未明確，其相關靶點的相互作用還有待進一步研究。

綜上所述，本研究中發現，連翹酯苷對模型大鼠具有明顯的利尿作用，且各劑量對大鼠腎臟組織無明顯影響，表明其可通過調節RAAS 發揮抑制腎小管重吸收作用，同時還可增加ANP，減少ADH，抑制Na＋，K＋－ATP酶活性來促進水鈉排泄，從而維持電解質和體液平衡，但不引起腎臟組織的變化，這為連翹的利尿作用機制提供了理論依據。