沒食子水提物對實驗性牙周炎的改善作用*

艾 林，高 鵬，李 愷，張若冰

（1.中國人民解放軍空軍軍醫大學空軍第九八六醫院，陜西 西安 710054；2.陜西省藥品監督管理局，陜西 西安 710065）

牙周炎臨床治療多采用刮治和根面平整方式，以降低菌群水平［1］。強力霉素等抗菌藥物可通過破壞基質金屬蛋白酶的作用而改變宿主對牙周病原體的反應，從而減少宿主自體介導的組織破壞，但全身使用抗菌藥物會導致多種不良后果［2］。牙齦組織是牙周炎初期最先受影響的組織，牙齦成纖維細胞是牙齦的主要細胞類型，可通過脂多糖（LPS）激活核因子κB（NF－κB）信號通路，產生白細胞介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性細胞因子。轉錄因子NF－κB 是炎性反應的關鍵成分［3］，骨保護素（OPG）和核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）的表達和激活對牙槽骨的吸收和代謝也起重要作用［4］。中藥或天然物質藥物治療牙周炎具有獨特優勢［5］。沒食子性寒、味苦，具有固澀、收斂、燥濕、止血功效，以及抗炎活性［6－8］。本研究中探討了沒食子水提物對LPS 誘導的大鼠牙齦成纖維細胞炎性反應和結扎誘導的實驗性牙周炎的抑制作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Western blot 熒光分析儀、聚合酶鏈反應儀、酶標儀（美國Bio－Rad 公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；SkyScan 1176 型微計算機斷層掃描儀（美國Bruker 公司）；Ambion－PARIS 系統。

試藥：沒食子（新疆奇康哈博維藥有限責任公司，批號 為20161112）；NF－κB、p－p65（批 號ab32536），p－IκBα（批號ab109300），胎牛血清（批號12103C），胰蛋白酶（批號T2600000），DMEM培養基（批號D08919）；IL－1β（批 號 I2393），TNF－α（批 號RAB0479），OPG（批 號RAB1134）和 可 溶 性RANKL（sRANKL）酶聯免疫吸附試劑盒（美國Sigma 公司）；抗體（英國Abcam 公司）；二甲基亞砜（DMSO）。

動物：Wistar 大鼠，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（陜）2018－002。本研究經空軍軍醫大學第九八六醫院動物倫理委員會批準。

1.2 方法

水提取物制備：取沒食適量子，粉碎為粗粉，加6 倍量水浸泡2 h，煎煮4 次，每次1 h，合并煎液，濾過，取續濾液；真空干燥為浸膏后稱定質量，待用。

細胞培養與分組給藥：切取無牙周病的6 周齡雄性Wistar 大鼠的正常牙齦組織，在含20%胎牛血清（FBS）、100 U／mL 青霉素和100 mg／mL 鏈霉素的DMEM 培養基中進行酶消化。細胞匯合后，用0.25%胰蛋白酶分離，在含10%FBS 及100 U／mL 青霉素和100 mg／mL 鏈霉素溶液的DMEM 中傳代培養。培養基每48 h 換液1 次，以第5～7 代間的牙齦成纖維細胞進行試驗。取成纖維細胞32 個，隨機分為A組、B組、C組、D組，各8 個。A組予1 μg／mL LPS，B組予LPS ＋10 μmol／L 沒食子水提物，C組予LPS ＋20 μmol ／L 沒食子水提物，D組予20 μmol／L 沒食子水提物＋正常成纖維細胞，作為空白對照。

大鼠分組、給藥與模型復制：取雄性Wistar 大鼠24 只，隨機分為E組、F1組、F2組，各8 只。F1組、F2組從結扎前1 d 開始每天用棉簽涂抹牙周組織30，100 μg／g 沒食子水提物，每天3 次，E組予等體積0.9%氯化鈉溶液。將正畸結扎絲固定在右側第一下磨牙的牙頸部，并用牙科探針劃破牙齦以復制牙周炎大鼠模型。

1.3 觀察指標

細胞活力：采用MTT 法，將牙齦成纖維細胞接種于96 孔板（每孔1×104個細胞）中，CO2培養箱（5%CO2、37 ℃、飽和濕度；孔內含50 U／mL 青霉素、10 mg／mL鏈霉素及10%FBS 的無血清DMEM 培養液）中培養12 h。各組細胞再用不同濃度的沒食子水提物再次孵育24 h，然后向每孔中添加20 μL MTT（5 mg／mL），培養4 h。去除培養基，并向每孔中添加150 μL DMSO。檢測450 nm波長處的吸光度（OD450）值。

相關因子水平：采用ELISA 法則各組細胞上清液中IL－1β，TNF－α，OPG，sRANKL 的水平。計算時所有檢測結果均減去空白對照值，根據標準液的檢測結果擬合出標準曲線，求出標本大鼠血清中OPG和RANKL 水平。

NF－κB 蛋白表達：提取牙齦成纖維細胞核，采用雙辛酸定量法檢測NF－κB 蛋白含量。各組取20 μg 上樣，10%SDS－PAGE 電泳后濕法電轉，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 清洗3 次，加入一抗，4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST 清洗3 次，加入二抗，室溫振搖1 h，回收二抗，TBST 清洗3 次，加入ECL 化學發光劑，將PVDF 膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。以條帶數字化后的目的條帶與內參條帶的變化值為各目的蛋白的相對表達量。

骨吸收：對E，F1，F2組大鼠進行顯微CT 分析（65 kV，380 μA），掃描分辨率為9 μm。三維分析和重建下頜骨組織，使用標準化灰度值計算體積。

膠原纖維：腹腔麻醉，處死E，F1，F2組大鼠，分離下頜骨，硬組織切片，脫礦，然后用0.1%天狼星紅染色60 min，用0.01 mol／L 鹽酸沖洗2 min，并固定密封，偏光顯微鏡下分析牙齦纖維。

1.4 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析。數據行單因素方差分析，組間比較采用SNK－q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牙齦成纖維細胞活力

B組和C組與D組成纖維細胞活力比較無顯著差異（P＞0.05），詳見圖1。

圖1 各組大鼠牙齦成纖維細胞活力Fig.1 The viability of gingival fibroblasts in each group

2.2 細胞及血清中炎性因子水平表達水平

與D組比較，A組大鼠的TNF－α和IL－1β 表達水平明顯升高（P＜0.05）。與A組比較，B組和C組大鼠的TNF－α和IL－1β 表達水平明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2。

A.TNF－α B.IL－1β注：與D組比較，*P＜0.05；與A組比較，＃P＜0.05。圖3及圖4 同。圖2 各組TNF－α和IL－1β 表達水平A.TNF－α B.IL－1βNote：Compared with those in group D，* P＜0.05；compared with those in group A，＃P＜0.05；as well as Fig.3 and Fig.4.Fig.2 The expression levels of TNF－α and IL－1β in each group

2.3 NF－κB 蛋白表達水平

與D組比較，A組sRANKL 及NF－κB 中p－p65和p－IκBα 水平均明顯升高，OPG／sRANKL 明顯降低（P＜0.05）；與A組比較，B組和C組sRANKL 及NF－κB中p－p65和p－IκBα 水平均顯著降低，OPG／sRANKL顯著升高（P＜0.05）。詳見圖3和圖4。

A.OPG B.sRANKL C.OPG／sRANKL圖3 各組OPG 及sRANKL 的表達水平A.OPG B.sRANKL C.OPG／sRANKLFig.3 The expression levels of OPG and sRANKL in each group

A.電泳圖 B.p－p65／H3 柱形圖 C.p－IκBα／H3 柱形圖圖4 各組NF－κB 表達水平A.Electrophoretic diagram B.p－p65 ／H3 column diagram C.p－IκBα／H3 column diagramFig.4 The expression level of NF－κB in each group

2.4 骨吸收及膠原纖維形態學

顯微CT 觀察，第一磨牙和第二磨牙間的下頜骨牙槽骨丟失。3D 重組圖像顯示，3組大鼠均出現牙槽骨缺損。A組牙槽骨嵴高度明顯降低，第一與第二磨牙間可見明顯的牙槽骨缺損；B1組和B2組牙槽骨缺損減少（見圖5）。天狼星染色顯示，A組膠原纖維破壞嚴重，纖維束分散無序，B1和B2組的膠原纖維破壞較輕（見圖6）。

圖5 3組大鼠骨吸收情況Fig.5 The bone loss of rats in the three groups

圖6 3組大鼠膠原纖維（天狼星紅色染色，×40）Fig.6 The collagen fibers of rats in the three groups（picro－sirius red staining，×40）

3 討論

沒食子已被證明有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種生物學特性［9］。《新修本草》記載其味苦，性溫，無毒；《本草從新》載其澀精固氣；《現代實用中藥學》載其主治濕熱疾病，如牙齦腫痛等。為沒食子治療牙周炎提供了依據［10］。有研究發現，沒食子提取物對大鼠進行灌腸，大鼠無明顯毒性反應［11］。本研究中采用MTT 法檢測了沒食子對大鼠牙齦成纖維細胞的細胞毒性作用。結果顯示，沒食子水提物處理的成纖維細胞與正常成纖維細胞無明顯差異，所以本課題組在動物實驗時未使用任何陰性或安慰劑對照來進行一致性比較，主要探討沒食子的抗炎作用機制。

TNF－α和IL－1β 為重要的促炎介質［12］，牙周炎發病初期，牙周細菌及其代謝產物首先侵入和刺激牙齦組織，IL－1β和TNF－α 也會過度表達［13－14］。ELLSA 結果顯示，沒食子能抑制LPS 誘導的大鼠牙齦成纖維細胞IL－1β和TNF－α 的產生，表明沒食子在調節牙周病相關免疫反應方面具有潛在作用。

本研究結果表明，沒食子可顯著抑制LPS 誘導的NF－κB 上調和磷酸化。NF－κB 的激活可刺激牙周病發展過程中發生的多種炎性反應，包括誘導黏附分子、激活基質金屬蛋白酶等。牙齦成纖維細胞NF－κB 的激活導致炎性細胞因子IL－1β和TNF－α 的過度釋放，進一步增強了牙周組織的破壞。IL－1β和TNF－α 也可增強破骨細胞的集聚和活化，激活RANKL，促進骨破壞［15］。

OPG和RANKL 的表達和激活對牙槽骨的吸收和代謝至關重要［16］。破骨細胞在RANKL／RANK 信號調控下與單核／巨噬細胞前體細胞分化。OPG 是一種分泌性蛋白質，通過與RANKL 結合并阻止其與RANK 結合來防止骨骼過度吸收。LPS 刺激牙齦成纖維細胞的sRANKL和OPG 通過旁分泌阻斷牙槽骨代謝。本研究結果表明，與LPS、沒食子共孵育后，牙齦成纖維細胞培養上清液中OPG／sRANKL 升高，表明沒食子可通過上調OPG／sRANKL 而減輕LPS 誘導的破骨細胞活化和牙槽骨吸收。

體內、組織學觀察和顯微CT 結果顯示，實驗性牙周炎大鼠可見牙齦炎癥和牙槽骨丟失，沒食子水提物可減輕牙齦炎癥和牙槽骨缺失程度。天狼星紅染色顯示，實驗性牙周炎大鼠的牙齦纖維束呈散在、紊亂狀態，而沒食子能減輕膠原纖維的破壞。

綜上所述，沒食子水提物可顯著減輕牙齦炎癥，調節膠原纖維和牙槽骨丟失，并能顯著抑制LPS 誘導的NF－κB 活化，降低OPG／sRANKL。