復方血栓通膠囊治療冠心病作用機制網絡藥理學研究

張燕麗，張志東

（暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510630）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病，CHD）的發生、發展基礎是脂質代謝異常，經過血管內皮損傷、脂質聚集、粥樣斑塊形成等系列病理變化，導致血管管腔狹窄甚至阻塞，從而引起冠狀動脈供血不足，導致心肌缺血、缺氧或壞死而引起心臟疾病，也稱為缺血性心臟病［1］。其屬中醫“胸痹”范疇［2］，也稱為心絞痛，長久“胸痹”可能會引發急性心血管事件而危及生命。中醫藥治療CHD 優勢獨特，其基礎研究及臨床研究中多以活血化瘀、通絡止痛、益氣養陰為主［3－5］。復方血栓通膠囊（CXST）由三七、丹參、黃芪、玄參組方，具有活血化瘀、益氣養陰之功效，臨床常用于治療視網膜靜脈阻塞［6－7］。CXST 具有擴張血管、改善血液循環等作用［8－9］，近年來逐漸用于治療血瘀兼氣陰兩虛證的CHD，并取得了較好療效［10－14］。目前的報道主要集中于組成CXST 的單味藥材中，而未見整方治療CHD 作用機制的相關報道。由于中藥成分的多樣性和疾病發生、發展的復雜性，沿用現代“一藥物、一靶點、一疾病”的研究模式難以闡釋中藥治病的作用機制［15］。網絡藥理學是集計算機模擬技術、生物信息學、高通量組學等于一體的新興學科［16－17］，可從分子生物網絡的角度，將藥物和疾病有機地關聯起來，系統揭示中藥治療疾病的作用機制。中醫藥強調的整體性和網絡藥理學的研究重點殊途同歸［18－19］。本研究中運用網絡藥理學方法探討了CXST 治療CHD 的作用機制，為CXST 的臨床應用提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 CXST 成分篩選

在中草藥系統藥理學平臺（TCMSP）數據庫中分別檢索CXST組方中三七、丹參、黃芪、玄參的活性成分及其藥代動力學參數（ADME）性質數據，將ADME 關鍵參數中口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選活性成分的指標［20－21］，獲得CXST 活性成分。在Pubchem 數據庫中獲得成分的SMILE 格式文件，并將其導入STITCH和Swiss Target Prediction 數據庫中，結合TCMSP 數據庫中獲取的靶點，去除重復部分，建立CXST 潛在靶點數據庫。

1.2 CHD 靶點確認和網絡構建及拓撲分析

在GeneCard，TTD，OMIM 數據庫中獲取與CHD 相關的靶點，刪除重復部分，建立本研究中所需的CHD 相關靶點數據庫。將1.1 項下獲取的成分靶點和CHD 疾病靶點導入韋恩圖在線繪圖軟件Venny 2.1.0，兩者交集部分即為CXST 治療CHD 的潛在作用靶點（交集靶點）。將交集靶點輸入String 數據庫中，獲得蛋白相互作用（PPI）網絡。將結果導入Cytoscape 3.6.1 軟件，構建CXST 治療CHD 的“成分－靶點－疾病”調控網絡，并對該網絡進行拓撲分析。

1.3 通路和組織富集

將1.2 項下交集靶點導入DAVID 6.7 數據庫，并進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析及基因本體論（GO）富集，以P＜0.05 為篩選條件，將KEGG 通路分析和GO 富集結果輸入Omicshare 平臺（https：／／www.omicshare.com／）作可視化圖示，并利用Cytoscape 軟件構建“成分－靶點－通路”網絡。使用其自帶的Network Analyzer 插件分析網絡節點的拓撲性質參數，包括度值（DG）、介數中心度（BC）及接近中心性（CC）［22－23］，以≥1 倍介數中心度和接近中心性的中位數及≥2 倍度值的中位數為篩選條件，數值越大，表明其成為活性成分關鍵靶點的可能性就越大。

1.4 分子對接驗證

在PDB 網站中下載蛋白結構文件，采用Autodock 1.5.6 及Discovery studio 2.5 軟件對靶點和成分進行預處理，并以靶點自帶的配體設置分子對接的結合口袋，再使用Autodock vina 對靶點和成分進行分子對接，結合能小于0 說明配體和受體可自發結合，鑒于目前分子對接結果的篩選尚無統一標準，本研究中暫定結合能≤－5 kcal／mol 為結合較好［24－26］。

2 結果

2.1 CXST 中活性成分篩選

從TCMSP 數據庫中分別獲得的活性成分有丹參202 個，三七119 個，黃芪87 個，玄參47 個，去掉重復的活性成分后共得427 個。上述4 味藥材中既有自屬成分，也有交叉成分，其中三七和丹參存在9 個共同活性成分，三七分別與玄參和黃芪存在3 個共同活性成分；丹參與黃芪存在6 個共同活性成分，丹參與玄參存在5 個共同活性成分；黃芪和玄參有4 個共同活性成分。詳見圖1。

圖1 CXST組方藥材成分韋恩圖Fig.1 Venn diagram of components of raw medicinal materials of Compound Xueshuantong Capsules

經OB和DL 值篩選后，獲得65 種丹參活性成分，16 種黃芪活性成分，9 種三七活性成分，9 種玄參活性成分。同時查閱文獻，發現三七總皂苷成分人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd和三七皂苷R1等均為三七的重要活性成分［27－29］。將符合篩選條件的活性成分刪除重復項，共篩選出CXST 的111 個潛在活性成分，其中包括黃酮、萜類、苷類、糖類、脂肪酸、氨基酸等化合物，如槲皮素、隱丹參酮、丹酚酸B、人參皂苷Rb1、L－賴氨酸等，其中，熊果酸和杉醇是丹參和玄參的共同活性成分，齊墩果酸是丹參和三七的共同活性成分，槲皮素是三七和黃芪的共同活性成分，β－谷甾醇是玄參和三七的共同活性成分，丹參、黃芪及玄參均與三七有共同活性成分，提示前三者對君藥三七起到了協同作用。詳見圖2。

圖2 CXST 潛在活性成分的“藥材－成分”網絡Fig.2 The ″raw medicinal material－component″ network of potential active components of Compound Xueshuantong Capsules

2.2 靶點確認和網絡構建及拓撲分析

獲得CXST 的潛在靶點369 個，CHD 相關靶點3 703 個，經Venny 軟件比對后獲得CXST 治療CHD 的潛在靶點168 個（見圖3 A、圖3 B）。對CXST 治療CHD的“中藥－成分－靶點”網絡分析結果可知（見圖3 C），該網絡的BC，CC，DC 的中位數分別為0.001 9，0.53，50，符合拓撲性質的靶點共18 個，包括PTGS2，VEGFA，AKT1，IL－6，TNF，CASP3，NOS3，MAPK14 等，提 示CXST 的活性成分與這些靶點有聯系，且與多數靶點存在相互作用關系，說明它們在CXST 治療CHD 的過程中起到了重要作用。詳見表1。

表1 關鍵靶點的拓撲參數信息Tab.1 Topological parameter information of key targets

2.3 KEGG 通路分析

生物通路是不同靶點構成的有序網絡，通過靶蛋白間的相互作用來執行特定的生物學功能，是闡釋疾病發生、發展和藥物治療疾病的生理學基礎［30］。將交集靶點投射到David 數據庫進行KEGG 通路富集分析，共富集出130 條生物通路，其中具有顯著性的通路122 條，主要涉及癌癥、炎癥、免疫、凋亡、循環、代謝等，經P＜0.05 篩選后，共獲得28 條。主要包括炎癥和信號傳導、凝血與纖溶、凋亡和增殖、脂質調控、血管再生和舒縮及鈣化、細胞遷移與聚集等6 個方面，體現了中藥CXST 具有的“整體調節、多靶治療”作用特色。詳見圖4。

圖4 CXST 治療CHD 的“靶點－通路”網絡Fig.4 The ″target－pathway″ network of Compound Xueshuantong Capsules in the treatment of CHD

2.4 GO 富集分析

進一步對成分靶點進行GO 功能富集分析，得P＜0.05的組織／器官／血液成分共17 個，對于五臟六腑，359 個靶點在肝部富集最顯著，共映射78 個靶點，富集靶點數量最多的為肺部，共映射82 個靶點，其次為心（19）、脾（26）、腎（40），六腑僅富集得到了小腸（14）。此外，胎盤富集了103 個靶點、血液富集了33 個靶點、血漿富集了19 個靶點、血小板富集了28 個靶點、白細胞富集了13 個靶點、T 細胞富集了14 個靶點、大腦富集了13 個靶點、主動脈內皮細胞富集了7 個靶點、臍靜脈富集了7 個靶點，表明CXST 活性成分在人體的分布和作用主要集中在肺組織和肝組織，血液成分和內皮細胞及免疫細胞中也有部分分布，該結果可為CXST 的歸經提供一定闡釋。

2.5 CXST 主要活性成分的靶點分析

中藥復方制劑在“共煎”過程中，藥物各活性成分間發生助溶、吸附、沉淀等，引起成分含量的改變，以及藥物活性成分間發生絡合、水解、氧化、還原反應產生新物質，絕非單味藥材中有效成分的簡單累加，在CXST 中主要含有人參皂苷Gh1、三七皂苷R1、丹酚酸B、黃芪甲苷Ⅰ、哈巴俄苷等15 個可定性定量的成分［31－37］。因此，對該15 個CXST 主要成分的相關靶點作進一步分析。結果表明，15 個主要成分共與68 個CHD 相關靶點存在聯系，富集獲得了115 條通路，其中P＜0.05 且與CHD 密切相關的通路28 條，利用成分－靶點和靶點－通路的關系構建“成分－靶點－通路”網絡（見圖5）。該網絡的BC，CC，DC 的中位數分別為0.003 2，0.52，29，符合拓撲性質的靶點共5 個，包括AKT1（0.10，0.78，80），VEGFA（0.035，0.72，68），COX－2（0.044，0.68，59），eNOS（0.016，0.68，58），MAPK14（0.057，0.71，66），提示這些靶點在CXST 治療CHD 過程中發揮著關鍵作用。在該網絡中，PI3K－Akt，HIF－1，TNF，MAPK，VEGF 等5 條信號通路最顯著，且與CHD 的發生、發展最緊密（見圖6）。

圖5 CXST 主要活性成分治療CHD 的“成分－靶點－通路”網絡Fig.5 The ″component－target－pathway″ network of main active components of Compound Xueshuantong Capsules in the treatment of CHD

圖6 CXST 主要活性成分靶點的KEGG 通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of main active component targets of Compound Xueshuantong Capsules

根據GO 富集分析（P＜0.05）結果，選擇P值較前的結果繪圖示意（見圖7）。如生物過程注釋（藍色）結果顯示，CXST 治療CHD 的靶標主要參與細胞增殖、系統循環、RNA 轉錄和炎性反應等過程的調節；細胞組分（黃色）富集結果顯示，CXST 治療CHD 的靶點主要集中于細胞外空間、質膜、細胞核等部位；分子功能（綠色）富集結果顯示，CXST 治療CHD 的作用主要體現在鋅離子結合、細胞因子活性和序列特異性DNA 結合等方面，提示CXST 的主要活性成分可能通過以上的生物功能達到治療CHD 的目的。

圖7 CXST 主要成分靶點的GO 富集分析生物功能注釋Fig.7 GO enrichment analysis of biological function annotation of main active component targets of Compound Xueshuantong Capsules

2.6 分子對接

CXST 的各主要活性成分與核心靶點具有不同程度的 結 合（見 表2），其 中 與VEGFA，AKT1，COX－2，eNOS，MAPK14 結合結果最好的分別為玄參苷，丹參酮Ⅰ，人參皂苷Rd，丹酚酸B，丹酚酸A，提示CXST 的活性成分之間具有協同增效關系。在5 個核心靶點中，結合結果較對照物好的活性成分基本集中在eNOS 上，其次為AKT1和COX－2，提示CXST 可能主要通過干預eNOS，AKT1，COX－2 的活性發揮治療CHD 的作用；雖然各成分與MAPK14和VEGFA 的結合結果無一優于對照物原配體，但部分成分（如丹酚酸B，隱丹參酮，丹參酮ⅡA，哈巴俄苷等）與兩者也呈現了較好的結合能力，對CXST 治療CHD 具有一定貢獻；與5 個核心靶點的結合中，丹參酮Ⅰ與eNOS，AKT1，COX－2 的結合均優于參照配體，其次人參皂苷Rg3，丹酚酸B，人參皂苷Rd 與eNOS和COX－2 的結合也均優于參照配體，提示單個成分可作用在多個靶點上，不同活性成分亦可作用在同一個靶點上，進一步突出了中藥成分間協同增效的特點。本研究中，與靶點結合最好的結果是丹參酮Ⅰ與AKT1 的結合（結合能為－9.7 kcal ／mol），故本研究中對該活性成分及其參照配體與AKT1 的相互作用進行可視化呈現。結果見圖8。

圖8 成分和參照配體與靶點的相互作用結果Fig.8 Interaction of components and reference ligands with targets

表2 主要活性成分與核心靶點的分子對接結果Tab.2 Molecular docking of main active components and key targets

3 討論

CHD 是高齡人群最常見的心血管疾病，是導致中老年患者死亡的首要疾病，其發生率和死亡率呈逐年上升趨勢［38］。目前，西醫治療CHD 以二級預防和冠脈血運重建術為主，且長期的化學藥物治療存在耐受性差、耐藥性強、藥品不良反應嚴重，以及手術治療經濟負擔重、手術禁忌證多、術后復發率高等問題［39］。中醫藥可有效治療CHD、心絞痛，改善預后，降低病死率［40］。在擴張冠脈、開放側支循環、改善流變學及心功能，保護心肌細胞、調節血脂、穩定斑塊、保護血管內皮等方面效果較好。CXST 由三七、丹參、黃芪和玄參4 味中藥組方。三七能縮短凝血時間，促使血塊溶解、促進纖溶，利于止血而不留瘀［41］；丹參能降低血液黏度，抑制紅細胞變形能力，改善紅細胞聚集性，有助于維持血運和預防血栓形成［42］；黃芪能提高機體抗脂質過氧化及清除自由基能力，改善微循環和血液流變性，降低血小板的黏附性，抑制血栓形成［43］；玄參能抑制血小板聚集，降低血漿纖溶酶原激活物抑制劑－1 的活性［44］。各藥協同共同發揮CXST 活血化瘀、益氣養陰的功效。

A，B.靶點確認 C.網絡構建圖3 CXST 治療CHD 的靶點確認及其“成分－靶點－疾病”網絡構建A.B.Target confirmation C.Network constructionFig.3 Target confirmation of Compound Xueshuantong Capsules in the treatment of CHD and the construction of ″component－targetdisease″ network

本研究中利用數據庫挖掘復方血栓通4 味中藥的活性成分，共得到111 個活性成分，對應369 個靶點，并從中確認168 個CXST 治療CHD 的潛在靶點，篩選得18 個關鍵靶點。同時，發現CXST 的111 個潛在活性成分中，有15 個是CXST 的主要活性成分，并確認了69 個CXST 治療CHD 的靶點，其中核心靶點有5 個。通過構建成分－靶點－疾病的可視化網絡，發現中藥含有多種活性成分，相同的活性成分可源于不同中藥；單一活性成分可對應多個靶點，同一靶點可與不同成分相關，充分體現了中藥多成分、多靶點的作用特點。

靶點作為藥物治療疾病的最小單位，并非獨立個體，存在相互作用的復雜網絡，可通過多個途徑或同一通路發揮多重或協同作用。本研究結果顯示，CXST 治療CHD 的潛在靶點富集形成了多條通路，并注釋了多種功能，主要與炎癥和信號傳導、凝血與纖溶系統、血管收縮舒張、內分泌系統、細胞凋亡與增殖、活性氧代謝等通路密切相關，并可平衡凝血與纖溶系統、調節血壓、穩定斑塊、恢復血管內皮功能、血流再灌注、活性氧代謝等相關的生物學過程。其中，與CHD 相關度最高的5 條通路中，PI3K－Akt 信號通路激活，可誘導內皮型一氧化氮合酶（eNOS）產生一氧化氮（NO），進一步調控凋亡途徑、炎性反應等，通過減少細胞內線粒體損傷、促進血管新生、抑制心肌細胞凋亡、改善梗死心肌重構、減小梗死面積、松弛血管平滑肌，實現改善血管的異常收縮和供血供氧及保護心臟血管，進而延緩CHD 的發生、發展［45］。HIF－1 信號通路激活受阻可發揮心肌保護效應，減輕缺血再灌注損傷，改善心功能，減少梗死面積［46］。促進MAPK 通路中ERK2（MAPK1）的活化和減少促凋亡通路JNK和MAPK14 通路的激活，可減輕心肌纖維化，具有明顯的心肌靶器官保護作用［47］。動脈粥樣硬化（AS）是CHD 的病理基礎，炎性反應貫穿了AS 的整個過程，與CHD 的發生、發展和預后過程密切相關［48－49］。當TNF等炎性通路受到抑制時，促炎因子（IL－6，TNF－α 等）和炎性介質（PGE2，NO 等）表達和釋放減少，起到抗AS作用，從而在一定程度上實現治療CHD 的目的［50］。在該條通路中，COX－2 作為誘導前列腺素E2（PGE2）產生的限速酶［51－52］。它的激活會致使炎性因子瀑布式級聯反應的增加，造成炎性損傷的惡性循環，加劇CHD患者的病情，因此抑制COX－2 活性可很大程度上減輕CHD 患者的炎性損傷。CHD 的主要證候要素包括血瘀、氣虛、痰濁［53］，VEGFA 是反映CHD 內皮細胞病理變化的重要標志物［54］，與血瘀證、氣虛證所致CHD 密切相關；VEGFA 是促進血管生成特異性最高、功能最強的調控因子之一，具有促進內皮細胞增殖分裂和血管功能修復等多種功能［55－56］。以上通路及富集在其中的靶點均參與CHD 的發生、發展，故可通過干預本研究中CXST 相關靶點及通路實現對CHD 的治療。

為驗證CXST 的主要物質基礎和核心靶點間的結合，本研究中對主要活性成分和核心靶點進行了分子對接，結果顯示，CXST 的主要活性成分對CHD 的關鍵作用靶點分子具有不同程度的結合活性，說明CXST 中含有的人參皂苷類、丹參酮類、丹參酸類、黃芪甲苷、哈巴俄苷等活性成分可與受體蛋白穩定結合并發揮作用。分子對接結果也為治療CHD 的單體藥物開發提供了候選化合物。

綜上所述，CXST 治療CHD 存在多維調控作用。本研究可為CXST 治療CHD 的作用機制提供一定依據。