除濕丸質(zhì)量評價方法研究

周德勇，龔 韜，楊 薇，嚴文利，朱 青，王 夏，宋京美

（北京市臨床藥學研究所，北京 100035）

除濕丸是北京中醫(yī)醫(yī)院用量最大的院內(nèi)制劑［1］，由梔子、連翹、黃芩、牡丹皮、地黃等藥材組方，有清熱涼血、祛濕解毒功效，主要用于治療大便黏滯、小便短赤、急性濕疹和脂溢性皮炎等癥［2］。方中主要含有連翹酯苷A、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、丹皮酚等化學成分，均有明顯的解熱、抗炎、抗氧化作用［3－4］。除濕丸的質(zhì)量標準中僅有薄層色譜定性鑒別［5］。本研究中參考文獻［6－7］，根據(jù)中醫(yī)配伍理論及中藥質(zhì)量標志物的確認原則［8］，將上述5 種主要化學成分確認為定量測定的目標成分［9－12］，用于除濕丸的質(zhì)量控制和評價。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nexera XR 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；XP105DR 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；KX－2127QT 型超聲波清洗機（北京科璽世紀科技有限公司）；TGL－16C 型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥

1.梔子苷 2.連翹酯苷A 3.黃芩苷 4.黃芩素 5.丹皮酚A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C－F.陰性對照品溶液（分別缺梔子、連翹、黃芩、牡丹皮）圖1 高效液相色譜圖1.geniposide 2.forsythoside A 3.baicalin 4.baicalein 5.paeonolA.Mixed reference solution B.Test solution C－F.Negative reference solution without Gardeniae Fructus，F(xiàn)orsythiae Fructus，Scutellariae Radix，Moutan CortexFig.1 HPLC chromatograms

梔子苷對照品（批號為110749－200410，含量98.7%），連翹酯苷A 對照品（批號為110820－201707，含量97.2%），黃芩苷對照品（批號為110715－201821，含量95.4%），黃芩素對照品（批號為111595－201808，含量97.9%），丹皮酚對照品（批號為110708－201407，含量99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；除濕丸（北京中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為1902035，1902019，1901057，1902047，1902017，1902018，1902030，1901061，1902012，1912007，190362，1904009，1810069，2007007，2007008）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Spursil 5 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時10%A→15%A，10～15 min 時15%A→18%A，15～20 min 時18%A →25%A，20～25 min 時25%A→40%A，25～30 min 時40%A→60%A，30～38 min 時60%A→75%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：238 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

分別取梔子苷、連翹酯苷A、黃芩苷、黃芩素、丹皮酚對照品適量，精密稱定，置同一10 mL 容量瓶中，用80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.372 4，0.252 0，0.214 4，0.404 8，0.261 0 mg／mL 的混合對照品貯備液；取1 mL置10 mL 容量瓶中，用80%甲醇定容，搖勻，濾過，即得混合對照品溶液。取樣品適量，研細，過2 號篩，取約0.25 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液15 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率30 kHz）處理90 min，取出，放冷，用80%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按除濕丸的處方工藝分別制備不含梔子、連翹、黃芩、牡丹皮的4 種陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備4 種陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液及4 種陰性對照品溶液各適量，按照2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，5 個被測成分分離度均良好，陰性對照無干擾。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液適量，制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積；以待測成分的進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of linear relation test of each component

精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件重復進樣6 次，測定。結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、黃芩苷、黃芩素、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.15%，0.49%，0.25%，0.20%，0.30%（n＝6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，室溫放置0，6，12，18，24 h 時分別按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、黃芩苷、黃芩素、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.46%，0.65%，0.35%，0.54%，1.20%（n＝5），表明室溫下供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為1904009）適量，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果梔子苷、連翹酯苷A、黃芩苷、黃芩素和丹皮酚平均含量分別為0.175%，0.133%，0.166%，0.225%，0.172%，RSD分 別 為0.49%，0.92%，0.88%，0.98%，1.55%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的樣品（批號為1904009）0.125 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，平行9 份，精密加入已知含量不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液各15 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取15 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以外標法計算5 個主成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 15 批樣品中5 種主成分含量Tab.3 Determination results of five principal components in 15 batches of samples

2.5 質(zhì)量分析

2.5.1 聚類分析

15 批樣品按5 個指標性成分含量之和可被聚為第1～11 批次和第12～15 批次兩類（見圖3），后者含量之和相對較高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)時間越近（即存儲時間越短）的樣品中5 個指標性成分含量之和越高。

圖3 15 批除濕丸聚類分析圖Fig.3 Dendrogram of 15 batches of Chushi Pills

2.5.2 主成分分析

將15 批樣品的5 個指標性成分的含量測定結(jié)果導入SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件，進行主成分分析，結(jié)果見表4。可知，前3 個主成分特征值大于0.5，累計方差貢獻率大于85%，故可用于樣品的質(zhì)量評價。

表4 主成分特征值和方差貢獻率Tab.4 Characteristic value and variance contribution rate of principal components

3 討論

預試驗中對超聲提取法和連續(xù)回流提取法進行了考察，發(fā)現(xiàn)超聲提取法效果較好；進一步考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)80%甲醇提取效率較高，且色譜峰基本無干擾，故選擇80%甲醇提取；并對提取時間（30，60，90，120 min）和加水量（40，60，80，100 倍）進行了考察，確定提取時間為90 min，加60 倍水；還考察了甲醇－水溶液、甲醇－0.1%磷酸水溶液、乙腈－水溶液、乙腈－0.1%醋酸水溶液、乙腈－0.1%磷酸水溶液等不同流動相的分離效果，結(jié)果表明乙腈－0.1%磷酸水溶液對5 個主成分的分離效果最好；對柱溫（30，35，40 ℃）的考察結(jié)果顯示，柱溫為40 ℃時分離效果最好。

15 批樣品中，丹皮酚含量差異最小，其次為梔子苷、黃芩素、連翹酯苷A、黃芩苷，黃芩苷含量最低，且差異最大。對批號相近的7 批樣品（1902012～1902047）進行分析，發(fā)現(xiàn)其5 個主成分的含量差異明顯小于15 批樣品，表明這7 批樣品的藥材來源可能相同，同時也表明，除濕丸的制備工藝穩(wěn)定。根據(jù)除濕丸處方工藝中的藥材比例，按2020 年版《中國藥典（一部）》各藥材成分的含量限度進行折算，各批次樣品中梔子苷、丹皮酚、連翹酯苷A 均符合藥典中的含量規(guī)定［8］，而15 批樣品中黃芩苷含量均不符合藥典關(guān)于黃芩藥材的含量限度要求，推測可能是由于原料藥材的黃芩苷含量較低，或是在制劑制備過程中黃芩苷大量損失。另外，15 批樣品中黃芩素的含量遠高于黃芩苷，但文獻［13－16］報道，黃芩藥材中黃芩苷的含量應(yīng)遠高于黃芩素，可能是由于黃芩苷在制劑制備過程中被其他藥材中的酶水解，或烘干溫度高和時間長造成黃芩苷水解，也有可能是兩者共同作用。因此，如何保證黃芩苷在除濕丸生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性，還有待進一步研究。

綜上所述，該方法簡便、快速，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可用于評價除濕丸的質(zhì)量。