稚兒靈顆粒質(zhì)量標準提升研究

李 佳，王 萍，金 華

（江蘇省淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300）

稚兒靈顆粒為《太平惠民和劑局方》參苓白術(shù)散加減方，現(xiàn)行標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第四冊）》，為國家基本藥物，由黨參、太子參、制何首烏、白芍（麩炒）、陳皮等24 味中藥材組方，具有益氣健脾、補腦強身功效，用于治療小兒厭食、面黃體弱、夜寢不寧、睡后盜汗等證［1］。現(xiàn)行質(zhì)量標準過于簡單，僅有性狀和制劑通則項目的檢查，無法從根本上保證藥品安全、有效、可控。本研究中參考文獻［2－3］，增加了方中黨參、太子參、制何首烏、白術(shù)（麩炒）、陳皮5 味藥材的薄層色譜（TLC）法鑒別，建立了同時測定稚兒靈顆粒中沒食子酸［4］、芍藥苷［5－6］和橙皮苷［7－8］含量的高效液相色譜（HPLC）法，為其質(zhì)量標準的提升提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAMAG 薄層色譜系統(tǒng)（配有Camag Automatic TLC Sampler 4 型薄層自動點樣模塊，Camag ADC 2 Automatic Developing Chamber 型薄層自動展開模塊，Camag TLC Visualizer 2 型薄層成像模塊，瑞士卡瑪公司）；Milli－QR 型超純水機（美國密理博有限公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器、自動進樣器、四元梯度泵、柱溫箱，安捷倫公司）；UltiMate3000 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，賽默飛公司）；AB204－N 型、XS205 DU 型電子天平（瑞士梅特勒公司，精度均為十萬分之一）。

1.2 試藥

硅膠G 預(yù)制板（青島海洋化工有限公司）；Merck KGaA 薄層板、高效板（德國默克公司）；甲醇為色譜純，磷酸、乙醇等試劑均為分析純，水為去離子水；黨參對照藥材（批號為121057－201206），太子參對照藥材（批號為121004－201408），白術(shù)對照藥材（批號為120925－201611），制何首烏對照藥材（批號為121454－201405），陳皮對照藥材（批號為120969－201510），沒食子酸對照品（批號為110831－201605，純度為90.8%），芍藥苷對照品（批號為110736－201638，純度為96.4%），橙皮苷對照品（批號為110721－201818，純度為96.2%），均購于中國食品藥品檢定研究院。稚兒靈顆粒共19 批，樣品信息見表1。

表1 樣品基本信息Tab.1 Basic information of the samples

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

黨參：取樣品（編號1）30 g，研細，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取黨參對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。按處方稱取缺黨參的其他藥材，按制備工藝制備缺黨參的陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法制備缺黨參的陰性對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502TLC 法［4］試驗，取供試品溶液5～10μL、陰性對照品溶液5 μL、對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇－乙醇－水（7∶2∶1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 A。

太子參：取樣品（編號1）30 g，研細，加甲醇30 mL，溫浸，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取太子參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按處方稱取缺太子參的其他藥材，按制備工藝制備缺太子參的陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法制備缺太子參的陰性對照品溶液。取供試品溶液5 μL、對照藥材溶液2 μL、陰性對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水（4∶1∶1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 B。

1－19.供試品溶液 20.對照藥材溶液 21.橙皮苷對照品溶液 22.陰性對照品溶液A.黨參 B.太子參 C.制何首烏（254 nm）D.白術(shù)（麩炒）E.陳皮圖1 薄層色譜圖1－19.test solution 20.reference medicinal material solution 21.hesperidin reference solution 22.negative reference solutionA.Codonopsis Radix B.Pseudostellariae Radix C.Polygoni Multiflori Radix（254 nm）D.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma（stir－fried with bran）E.Citri Reticulatae PericarpiumFig.1 TLC chromatograms

制何首烏：取樣品（編號1）40 g，研細，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加水30 mL 使溶解，加鹽酸1 mL，加熱回流1 h，放冷，加二氯甲烷振搖提取3 次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取制何首烏對照藥材1 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。按處方稱取缺制何首烏的其他藥材，按制備工藝制備缺制何首烏的陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法制備缺制何首烏的陰性對照品溶液。取供試品溶液20 μL、對照藥材溶液5 μL、陰性對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲酸（8∶2∶0.1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的橙黃色熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。

白術(shù)（麩炒）：取白術(shù)對照藥材0.5 g，加水煎煮2 h，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次15 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。按處方稱取缺白術(shù)的其他藥材按制備工藝制備缺白術(shù)（麩炒）的陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法制備缺白術(shù)的陰性對照品溶液。吸取上述溶液及黨參鑒別中供試品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－丙酮－甲酸（9.5∶0.5∶0.06，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 D。

陳皮：取樣品（編號1）30 g，研細，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材0.5 g，同法制備對照藥材溶液。再取橙皮苷適量，用甲醇制成飽和溶液，即得橙皮苷對照品溶液。按處方稱取缺陳皮的其他藥材，按制備工藝制備缺陳皮的陰性對照樣品，同供試品溶液制備方法制備缺陳皮的陰性對照品溶液。吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（100∶17∶13，V ／V ／V）為展開劑，展距約為3 cm，取出，晾干，再以甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水（20∶10∶1∶1，V／V／V／V）的上層溶液為展開劑，展開，展距約為12 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯4 個相同顏色的熒光主斑點，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1 E。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP－ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.02%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL／min；檢測波長：多波長檢測，270 nm（沒食子酸），230 nm（芍藥苷），284 nm（橙皮苷）；進樣量：10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 The gradient elution program of mobile phase

2.2.2 溶液制備

取沒食子酸對照品20.52 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為沒食子酸貯備液；取芍藥苷對照品10.18 mg、橙皮苷對照品17.18 mg，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，精密加入沒食子酸貯備液10 mL，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。取混合對照品貯備液3 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品，研細，取粉末5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲45 min，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按稚兒靈顆粒處方和工藝制備缺白芍（麩炒）、陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)按沒食子酸、芍藥苷和橙皮苷峰計均不低于5 000，分離度大于1.5，基線分離良好。色譜見圖2。

專屬性試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液、陰性對照品溶液和供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照品溶液在與沒食子酸、芍藥苷和橙皮苷對照品相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對照品貯備液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分含量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（n＝7）Tab.3 The regression equation，correlation coefficient and linear range of each component（n＝7）

精密度試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液（沒食子酸質(zhì)量濃度為10 μg／mL，芍藥苷為30 μg／mL，橙皮苷為60 μg／mL），按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次。結(jié)果沒食子酸、芍藥苷、橙皮苷峰面積的RSD均小于2.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸、芍藥苷、橙皮苷峰面積的RSD均小于2.0%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品，精密稱定，共6 份，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果沒食子酸、芍藥苷、橙皮苷含量的RSD均小于2.0%（n＝6），表明方法重復性良好。

1.沒食子酸（274 nm）2.芍藥苷（230 nm）3.橙皮苷（284 nm）A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.gallic acid（274 nm）2.paeoniflorin（230 nm）3.hesperidin（284 nm）A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

加樣回收試驗：取已知含量的樣品6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of the recovery test（n＝6）

耐用性試驗：取樣品（編號1），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，分別以不同儀器（UltiMate3000 型高效液相色譜儀、Agilent 1260 型高效液相色譜儀）、不同色譜柱（Agilent Eclipse XDB－C18柱、Shimadzu VPODS C18柱）進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果各成分峰相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明方法耐用性較好。

2.2.4 樣品含量測定

對不同廠家和同廠家不同批號的19 批樣品的含量進行測定，每份樣品平行測定2 次。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（mg／g，n＝2）Tab.5 Results of content determination of gallic acid，paeoniflorin and hesperidin in the samples（mg／g，n＝2）

3 討論

3.1 TLC 條件選擇

TLC 法利用吸附劑對樣品中各成分吸附能力不同，展開劑對其解吸附能力也不同，使各成分達到分離目的［9］。稚兒靈顆粒中含有多味藥材，成分復雜，影響各成分的分離干擾因素眾多。根據(jù)不同味藥及其化學成分的物理特性，分別對黨參［10］281、太子參［10］68、制何首烏［10］468、白術(shù)（麩炒）［10］463、陳皮［10］191的前處理方法及展開劑的組成配比進行了反復試驗，并采用自制硅膠板、普通預(yù)制板、默克硅膠板及高效板反復考察了其重復性，最終確定了本研究中黨參、太子參、制何首烏、白術(shù)、陳皮5 味藥材的TLC 鑒別方法，并達到了良好的定性鑒別效果。

3.2 定量指標成分選擇

方中陳皮的主要藥效成分為橙皮苷，具有理氣健脾、燥濕化痰功效［10］191；芍藥苷為白芍的指標性成分，具有緩急止痛、抗炎、抑菌等作用［11－12］；沒食子酸作為白芍、制何首烏和木香3 味中藥材的共有成分，抗菌、抗病毒、抗炎作用顯著［13］。故被選為定量指標成分。

3.3 流動相選擇

曾考察乙腈－0.2%冰醋酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.02%磷酸溶液，結(jié)果以乙腈－0.2%冰醋酸溶液作為流動相時基線毛刺大，溶劑有倒峰；采用乙腈－0.1%磷酸溶液或乙腈－0.02%磷酸溶液洗脫時，兩者差異不大，基線平穩(wěn)，各待測組分峰形較好，分離度達到要求，且陰性對照無干擾。故選擇乙腈－0.02%磷酸溶液為流動相。

3.4 提取溶劑選擇

曾考察以相同體積的甲醇、50%甲醇、稀乙醇進行超聲提取，按擬訂色譜條件測定，結(jié)果以稀乙醇為提取溶劑時含量最高，穩(wěn)定性最好，峰形對稱，分離度較好。故選擇稀乙醇為提取溶劑。

3.5 方法評價

本研究中對6 個廠家的19 批稚兒靈顆粒進行了TLC 鑒別和HPLC 法含量測定，結(jié)果廣西萬壽堂的各成分含量較其他廠家的略低，而貴州遠程的各成分含量均明顯高于其他企業(yè)，提示該企業(yè)在原料的選擇和工藝的流程設(shè)計方面有明顯優(yōu)勢。本研究中在原標準基礎(chǔ)上增加了5 種藥材的TLC 法，建立了同一系統(tǒng)同一供試品溶液測定多種成分的HPLC 法，簡便穩(wěn)定，準確可靠，可為生產(chǎn)企業(yè)和檢驗部門提供全面地檢測產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)。