風(fēng)濕二十五味丸中非法添加的松香酸檢測

盧 洋，劉益慶

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 連云港 222006）

風(fēng)濕二十五味丸為獨(dú)家品種，主要由驢血粉、檀香、紫檀香、苦參、楓香脂、草決明等25 味藥材組方。蒙醫(yī)認(rèn)為其主要功效為燥“協(xié)日烏素”、散瘀，故常用于治療游痛癥、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕等疾病［1］。方中楓香脂為貴重藥材，有些商家為了謀求利益最大化，常在該藥材中添加廉價(jià)易得的松香酸代替，而松香酸屬萜類化合物，常用于發(fā)酵工業(yè)或造紙業(yè)等，有毒［2］。原國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2016 年發(fā)布了楓香脂中松香酸檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。目前關(guān)于松香酸的檢測方法主要有薄層色譜法［3－6］、高效液相色譜（HPLC）法［7－10］和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［11－14］。本研究中建立了風(fēng)濕二十五味丸中松香酸的檢測方法，并對檢出的陽性樣品進(jìn)行了確認(rèn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient1260 型高效液相色譜儀，6530B Accutate－Mass Q－TOF 型質(zhì)譜儀（美國Aglient 公司）；XP2U 型微量電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；BT125D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ－300DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

松香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111938－201201，含量為98%）；風(fēng)濕二十五味丸（烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號分別為141128，150807，160427，160428，160532，160646，160804，160856，160935，160936，160937，170433，180810）；甲酸、乙腈均為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸－乙腈（28∶72，V／V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：241nm；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取松香酸對照品25.90 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為對照品貯備溶液；精密量取3 mL，置50 mL 容量瓶中，加乙醇定容，即得對照品溶液。取樣品10 丸，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醇10mL，超聲（功率300W，頻率40kHz）處理20 min，放至室溫，上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按風(fēng)濕二十五味丸處方和工藝制備缺楓香脂的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下3 項(xiàng)溶液各10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按松香酸峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。陰性對照品溶液色譜圖中，在與松香酸對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，專屬性良好。結(jié)果見圖1。

1.松香酸A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.abietic acidA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2 項(xiàng)下對照品貯備溶液適量，加乙醇制成每1 mL 中分別含松香酸32.375，64.750，129.500，259.000，518.000 μg 的系列對照品溶液，搖勻，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以松香酸的質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝21.947X＋22.736（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，松香酸質(zhì)量濃度在32.375～518.000 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限考察：將2.1.2 項(xiàng)下對照品溶液用乙醇倍比稀釋，信噪比（S／N）為3 時(shí)，最低檢測質(zhì)量濃度為0.5 μg／mL，按本方法取樣量0.1 g 計(jì)算，則檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 μg／g，如取樣濃度增加，會污染質(zhì)譜的離子源，故方法的檢測限定為50 μg／g。信噪比（S／N）為10 時(shí)，檢測質(zhì)量濃度為2 μg／mL，按本方法取樣量0.1 g 計(jì)算，則定量限為200 μg／g。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下對照品溶液10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為160427）適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.61%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為160427）適量，共9 份，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.540 0 mg／mL 的松香酸對照品溶液1.0，2.0，3.0 mL，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n＝9）

2.2 成分確認(rèn)

2.2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC－C18柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸－乙腈（28∶72，V／V）；流速為0.3mL／min；檢測波長為241nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為0.5 μL。

質(zhì)譜條件：正離子模式（ESI＋）掃描；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；毛細(xì)管出口電壓為175 V；干燥氣流速為8 L／min；干燥氣溫度為300 ℃；霧化器壓力為35 psig；碰撞能量為15 eV；掃描范圍m／z為100～1 000。

2.2.2 檢測結(jié)果

取2.1.2 項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見圖2和圖3。供試品溶液在與對照品溶液相同保留時(shí)間處有相應(yīng)離子峰，且一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜與對照品溶液基本一致，ESI＋掃描一級質(zhì)譜m／z303.22［M ＋H］＋，以m／z303 為母離子的二級質(zhì)譜m／z257.22［M－COOH］＋、149.13［M－COOH－C6H6（CH3）2］＋、123.11［M ＋H－COOH－C6H6CH2CH（CH3）2］＋。陰性對照品溶液圖譜中未見相同的質(zhì)譜峰。

A.一級質(zhì)譜 B.二級質(zhì)譜圖2 對照品溶液質(zhì)譜圖A.MS1 B.MS2Fig.2 Mass spectrogram of reference solution

3 討論

楓香脂中松香酸檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法中，HPLC 法的流動相為乙腈－四氫呋喃－1%甲酸（35∶25∶40，V ／V ／V），本試驗(yàn)中采用0.1%甲酸－乙腈（28∶72，V／V），經(jīng)預(yù)試驗(yàn)比較，后者組分簡單經(jīng)濟(jì)，色譜峰形佳，分離效果好，故選其為流動相。預(yù)試驗(yàn)中考察了不同品牌的色譜柱［包括OmniGene LLC Hubble C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Aglient Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），YMC Hydrosphere C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，流動相比例［0.1%甲酸－乙腈（25∶75，30∶70，35∶65，V／V）］，柱溫（17，20，23 ℃），波長（239，241，243 nm），流速（0.9，1.0，1.1 mL／min）對檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)其中微小的變動對定性的結(jié)果影響不大，但在柱溫升高、乙腈比例加大時(shí)會降低分離度。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，本研究中所建立HPLC 法能對風(fēng)濕二十五味丸中松香酸成分進(jìn)行有效檢查，并采用UPLC－Q－TOF－MS 法對檢查出的陽性樣品進(jìn)一步確認(rèn)，可有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。采用該方法對該廠家的13 批樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2018 年前幾乎全為松香酸陽性樣品，說明當(dāng)楓香脂中松香酸檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法發(fā)布后的短時(shí)間內(nèi)，廠家并未意識到用其控制楓香脂藥材的質(zhì)量，但在2018 年后，該品種幾乎均為松香酸陰性樣品，說明廠家已開始重視楓香脂藥材的質(zhì)量安全。可見，建立風(fēng)濕二十五味丸中松香酸的檢驗(yàn)方法，能有效監(jiān)管制劑中非法添加松香酸，保障公眾的用藥安全和療效。

A.一級質(zhì)譜 B.二級質(zhì)譜圖3 供試品溶液質(zhì)譜圖A.MS1 B.MS2Fig.3 Mass spectrogram of test solution