羥基紅花黃色素A對非酒精性脂肪肝炎細胞的作用

張華敏，劉娜，鄧巧娟

（廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524000）

非酒精性脂肪性肝病（non alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除病毒或酒精等因素引起的肝損傷，國內目前有超過1.5億患者，其中20%~40%患者發展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）[1-2]。細胞焦亡是近年來發現并證實的一種新的程序性細胞死亡方式，目前已有研究表明細胞焦亡在NASH的發展中起著至關重要的作用[3-4]。

羥基紅花黃色素A是一種單查爾酮類化合物，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎癥、抗血小板凝集等活性。LI Y N[5]等研究表明羥基紅花黃色素A對于肝纖維化有一定的療效。HE Y[6]等研究表明羥基紅花黃色素A對大鼠酒精性肝損傷具有保護作用。本研究采用游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）處理L-02細胞建立NASH細胞模型，在此基礎上觀察和測定羥基紅花黃色素A對NASH的影響，并探尋其作用機制是否與肝細胞細胞焦亡有關，從而為NASH的臨床治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞L-02細胞系購于中科院上海細胞庫，將細胞解凍后離心，加入DMEM培養基，于37℃，5%CO2條件下培養。

1.2 藥物與試劑 羥基紅花黃色素A（上海士鋒生物科技有限公司，貨號：78281-02-4，純度≥98%）；DMEM（美國Gibco公司，貨號：12100046）；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：16000044）；油紅O染色液（上海生工，貨號：E607319-0010）；油酸（上海生工，貨號：A502071-0250）；棕櫚酸（上海純優生物，貨號：P0687）；一步法反轉錄熒光定量試劑盒（上海生工，貨號：B639277-0050）；Trizol（上海生工，貨號：B610409-0025）；炎癥小體感受器分子NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）兔單克隆抗體（艾博抗公司，貨號：M00034）；半胱氨酸蛋白酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）兔單克隆抗體（艾博抗公司，貨號：ab207802）；消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）兔單克隆抗體（艾博抗公司，貨號：ab209875）；白細胞介素-18（IL-18）兔多克隆抗體（艾博抗公司，貨號：ab207324）；白細胞介素-1β（IL-1β）兔多克隆抗體（英國abcam，貨號：ab9722）；磷酸甘油脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（英國abcam，貨號：ab9485）；HRP標記二抗（英國abcam，貨號：ab30451）。

1.3 主要儀器HERAcell150i型CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）；51029702型超凈臺（Thermofisher公司）；680型酶標儀（Bio-Rad公司）；CFX96型PCR儀（Bio-Rad公司）；PowerPac Basic型電泳儀（Bio-Rad公司）；AlphaImager HP型凝膠成像系統（美國阿爾法公司）。

1.4 分組與給藥 將油酸或棕櫚酸溶解于無水乙醇中，制備為50 mmol/L的儲存液。羥基紅花黃色素A溶解于DMEM培養基，濃度為500 mg/L。實驗分為對照組、模型組和羥基紅花黃色素A組，對照組為不做處理的人正常肝臟細胞L-02，模型組用500μmol/L的FFA（油酸∶棕櫚酸=2∶1）處理L-02細胞24 h，羥基紅花黃色素A組在模型組基礎上用0.2 mg/mL的羥基紅花黃色素A處理細胞24 h，羥基紅花黃色素A處理時間和方法參考文獻[5]。

1.5 油紅O染色檢測各組細胞中的脂質沉積 將油紅O工作液加入各組細胞中，室溫孵育60 min，棄染色液，用PBS清洗后，顯微鏡下觀察拍照。

1.6 ELISA檢測各組細胞內ALT、AST、SOD、MDA、IL-18、IL-1β含量 收集各組細胞，2 500 r/min離心20 min，收集上清備用。按照各自ELISA檢測試劑盒說明書檢測細胞內谷丙轉移酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、IL-18、IL-1β含量。

1.7 RT-qPCR檢測細胞中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達水平 收集各組細胞，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉錄熒光定量試劑盒檢測NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達水平，以GAPDH為內參。RT-qPCR反應程序見說明書。引物如下，NLRP3正向：5'-GCGCCTCAGTTAGAGGATGT-3'，反向：5'-ACCAGCTACAA AAAGCATGGA-3'；Caspase-1正向：5'-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3'，反向：5'-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3'。GSDMD正向5'-CCATCGGCCTTTGAGAAAGTG-3'，反向：5'-ACACATGAATAACGGGGTTTCC-3'；GAPDH正向：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向：5'-GGGGTCATT GATGGCAACAATA-3'。

1.8 Western blotting檢測各組細胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達 收集各組細胞，分別加入RIPA裂解液，冰上放置20 min后，4℃13 000 r/min離心20 min，取35μg總蛋白進行SDS-PAGE，轉PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗（1∶1 000）4℃過夜，以GAPDH抗體（1∶10 000）為參照，再加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝膠成像系統分析結果。

1.9 統計學方法 數據均采用SPSS 21.0軟件進行分析。符合正態分布的計量資料用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 油紅O染色結果 對照組細胞內未出現紅色脂滴，模型組細胞紅色脂滴較多，細胞腫脹，細胞間隙變大；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組紅色脂滴減少，細胞腫脹得到改善。（見圖1）

圖1 油紅O染色結果圖（×400）

2.2 羥基紅花黃色素A抑制NASH炎癥反應及氧化應激 與對照組比較，模型組IL-18、IL-1β、MDA明顯升高（P＜0.05），SOD明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組IL-18、IL-1β、MDA明顯下降（P＜0.05），SOD明顯升高（P＜0.05），提示羥基紅花黃色素A能夠改善NASH炎癥反應和氧化應激。（見圖2~3）

圖2 各組細胞炎癥因子含量比較（±s，n=3）

圖3 各組細胞MDA、SOD含量比較（±s，n=3）

2.3 羥基紅花黃色素A改善NASH肝細胞損傷 與對照組比較，模型組AST、ALT含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組AST、ALT含量明顯下降（P＜0.05），提示羥基紅花黃色素A能夠改善肝細胞損傷。（見圖4）

圖4 各組細胞ALT、AST含量比較（±s，n=3）

2.4 羥基紅花黃色素A抑制NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、GSDMD mRNA的表達 與對照組比較，模型組NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達水平明顯下降（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組細胞NLRP3 mRNA、GSDMD mRNA、Caspase-1 mRNA表達水平比較（±s，n=3）

2.5 羥基紅花黃色素A抑制NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達 與對照組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達明顯下降（P＜0.05）。（見圖6）

圖6 各組細胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達比較（±s，n=3）

3 討 論

隨著對NASH發病機制研究的深入，目前越來越多研究表明炎癥反應是NASH的主要誘導因素，而肝臟脂質過氧化導致的氧化應激也會加重對肝臟的損傷[7-9]。IL-1β和IL-18是炎癥因子，在NASH發展中加重肝臟炎癥反應；SOD具有抗氧化的作用，而MDA是脂質過氧化產物，二者分別代表著抗氧化能力和氧化損傷程度；ALT和AST反映肝功能損傷程度，當肝細胞受損時，ALT和AST會呈升高狀態[10-11]。李風林等[12]發現非酒精性脂肪肝病大鼠血清IL-1β、IL-18含量較對照組明顯升高。楊素貞等[13]對NASH模型大鼠及正常大鼠血清ALT、AST、肝組織中MDA和SOD進行檢測，發現模型組大鼠ALT、AST、MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降。羥基紅花黃色素A具有單查爾酮苷類結構，是紅花黃色素的有效成分。近幾年已有研究表明，羥基紅花黃色素A可通過抑制活性氧的生成，調節SOD和MDA的活性來緩解氧化應激[14]。此外，羥基紅花黃色素A能抑制炎性細胞因子IL-1β，TNF-α的表達[15-16]。因此，推測羥基紅花黃色素A抑制NASH的發生發展可能與抑制氧化應激反應和炎癥反應有關。為了驗證推測，本研究采用FFA處理L-02建立NASH細胞模型，經羥基紅花黃色素A處理后，L-02細胞的氧化應激和炎癥水平明顯降低，且AST、ALT含量明顯下降，這與推測結論一致。此外，羥基紅花黃色素A處理細胞的劑量0.2 mg/mL是經過參考文獻及前期MTT預實驗篩選確定的，羥基紅花黃色素A在0~0.2 mg/mL的范圍內細胞存活率較高，為非細胞毒性劑量。

細胞焦亡是一種依賴于Caspase的炎性細胞死亡形式，伴隨著細胞腫脹，質膜孔洞形成，調控大量促炎性細胞內容物釋放[17]。目前已有研究表明肝臟庫普弗細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和肝細胞都能發生焦亡參與NASH發生機制的調節[18]。NLRP3屬于Nod樣受體家族，由凋亡相關斑點樣蛋白、核苷酸結合寡聚化結構域及半胱氨酸蛋白酶1前體蛋白3部分組成，其通過激活并裂解pro caspase-1來調控成熟IL-1β和IL-18的釋放，誘導細胞焦亡，進而擴大炎癥反應[19]。目前已有研究表明敲除NASH模型小鼠肝組織NLRP3基因后可抑制炎性反應，緩解脂肪變性和肝炎病情[20]。GSDMD基因定位于人染色體8q24，因具有質膜成孔活性成為Caspase-1和Caspase-11介導的細胞焦亡的主要執行者。YANG Y[21]等研究表明激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡信號通路可以促進人類子宮內膜癌細胞焦亡。本研究結果顯示模型組細胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β均被激活，說明NASH介導了細胞焦亡，而經羥基紅花黃色素A處理后，L-02細胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β表達水平明顯降低，這與MRIDHA A R等[20]的研究和XU B[22]等的研究結果相似，提示羥基紅花黃色素A可以抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡信號通路激活。

綜上所述，羥基紅花黃色素A可減輕L-02細胞的炎癥反應和氧化應激水平，抑制肝細胞焦亡，從而改善NASH肝細胞損傷，可能與其抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡信號通路的激活有關。然而羥基紅花黃色素A通過何種途徑抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡信號通路有待進一步研究。