基于網絡藥理學探討丹參-黃芪-川芎配伍治療冠心病心絞痛的作用機制

張 淼，李丹丹，馬 民，金 宇，陳啟庭，殷惠軍

安德魯 · L · 霍普金斯首先提出了網絡藥理學的概念[1-2]。近年來，中醫中藥研究也開始與網絡藥理學及現代醫學等多學科進行融合，對中醫藥網絡藥理學這一比較新興的交叉學科的形成以及推廣應用起到了助力的作用[3]。中醫講究整體論治，而大多數的中醫藥制劑成分結構較為復雜，靶點作用機制尚不清晰。目前，中醫中藥對疾病的治療大多認為是一個復雜且涉及多靶點、多組分的過程，中醫藥網絡藥理學可以對上述中醫中藥在治療臨床疾病中的有關基因網絡的多靶點復雜協同作用進行初步的評價及分析，通過相關數據庫的信息，構建、識別以及分析疾病/藥物相關的網絡及其有關信號通路，這對進一步探討和研究傳統醫藥治療疾病時的具體作用機制有重要意義[4]。冠心病心絞痛的發生發展是一個多基因參與、多階段、多因素的復雜過程，該病的病理機制主要有異常血管狀態、血栓形成、血液黏度增高、血小板活化及聚集等[5]，氣虛血瘀證是冠心病心絞痛在傳統醫學臨床中最常見的一種證候類型，治以益氣活血，此法應用廣泛、療效明確[6]。益氣活血常用中藥中，丹參活血化瘀，黃芪益氣補養心氣，川芎行氣活血止痛，三藥合用活血而不耗氣，益氣而不壅滯，在中醫臨床上作為防治冠心病心絞痛的有效藥物被廣泛配伍使用，但益氣活血類中藥的有效活性組分以及這些組分的效應靶點、藥理學機制目前仍然不明確。本研究利用網絡藥理學的方法預測和分析丹參-黃芪-川芎配伍發揮治療冠心病心絞痛作用的可能靶點、活性成分以及信號通路，為深入探討丹參-黃芪-川芎改善冠心病心絞痛的分子機制奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 潛在靶點網絡的構建 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索丹參、黃芪、川芎的靶點及其所有活性成分。設置丹參、川芎的篩選條件為類藥性(DL)>0.18以及口服利用度(OB)>30%；黃芪的篩選條件為DL>0.18和OB>40%。使用Cytoscape 3.7.0軟件構建網絡。

1.2 構建成分-靶點網絡 Cytoscape 3.7.0軟件具有Merge功能，利用該功能對疾病-藥物共同的靶點進行分析。

1.3 構建冠心病心絞痛靶點網絡 以“angina pectoris”為關鍵詞，分別在DrugBank、TTD(Therapeutic Target Database)和PharmgKb數據庫進行檢索，得到疾病靶點，在Uniprot平臺上轉換基因蛋白名，對疾病靶點的可視化網絡采用Cytoscape 3.7.0軟件構建。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集通路可視化分析 利用DAVID數據庫，分析疾病-藥物的共同靶點的KEGG富集途徑。

2 結 果

2.1 丹參、黃芪、川芎成分潛在靶點網絡 通過檢索以及對相關指標的設置，將得到85個藥物效用活性組分進行構建，獲得包含了243個節點的丹參-黃芪-川芎的靶點可視化網絡。用長方形代表靶點，菱形代表成分，丹參的活性組分使用紅色表示，黃芪的活性組分使用黃色表示，川芎的活性組分則使用綠色表示。詳見圖1。

圖1 黃芪-丹參-川芎配伍的成分-潛在靶點網絡

2.2 冠心病心絞痛靶點網絡 通過檢索關鍵詞“angina pectoris”，獲得疾病的直接靶點共有30個，在UniProt平臺將蛋白名轉換為標準基因名，再進行構建，之后得到可視化網絡圖(見圖2)，冠心病心絞痛的30個直接靶點具體包括：FGF4、TBXA2R、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、F10、PDE5A、ADRB3、CPT1B、ITGB3、ITGA2B、SCN3A、KCNA5、SLC29A1、KCNH2、ADRB1、CACNA1H、F8、TBXAS1、SLC9A1、ADRB1、HGF、DRD2、P2RY12、PON1、HCN1、SLC9A3、NOS3、CACNA1C、VEGFD。詳見表1。

圖2 疾病靶點可視化網絡圖

表1 30個疾病直接靶點

2.3 成分-疾病靶點網絡 對丹參-黃芪-川芎的 “疾病靶蛋白-蛋白質相互作用網絡” 以及 “組分潛在靶點網絡”進行進一步的分析，生成 “成分-疾病靶點網絡”圖(見圖3，橢圓表示效用活性組分，菱形則表示靶點)，成分-疾病靶點網絡的靶點有13個，其中包括7個活性成分(分別為 MOL000098、MOL007145、MOL000371、MOL000378、MOL007049、MOL007122、MOL007154)以及6個疾病靶點(分別為 ADRB1、ITGB3、PON1、ADRA2B、ADRA2A、ADRA2C)。

圖3 有效成分靶點網絡圖

2.4 KEGG富集通路信息 對13個靶點進行富集分析獲得3條信號通路(見表2)，作用于這3條信號通路的活性成分共有11個(見表3)。

表2 共同靶點KEGG富集信息

表3 作用于活化通路靶點的活性成分

3 討 論

整體觀念和辨證論治是傳統醫學的重要特點，中藥基于傳統醫學的以上特點在分子水平上通過多靶點、多組分達到治療目的。作為中醫藥與網絡藥理學的交叉學科，中醫藥網絡藥理學已成為一種相對比較新的研究范式，廣泛應用于對中藥作用機制的探索、解釋[7]。它可通過生物網絡以及分子層面對中醫藥的作用機制進行深入的探討，推進中醫藥的科學化、國際化以及現代化。臨床治療冠心病心絞痛的常用中藥為丹參、黃芪、川芎，三藥合用較單獨使用能協同增強益氣和活血的功效。本研究利用網絡藥理學的研究方法，篩選分析得到85個活性成分以及243個靶點，與冠心病心絞痛的30個直接靶點進行相互映射，得到共同靶點13個，再通過對這13個共同靶點進行KEGG通路富集分析，獲得了3條相關的信號通路，共有11個活性組分可以作用于這3條相關信號通路。充分體現了中醫藥治療疾病的系統性、整體性、多靶點、多途徑、多成分的優勢特點，同時發現，在治療疾病過程中，同一有效成分可以激活不同的信號通路和靶點，不同的有效成分也可以激活同一靶點，從而起到治療作用，這對中醫治療的異病同治、同病異治的作用機制進行了科學客觀的解釋[8]。

益氣活血類中藥被傳統醫學廣泛應用于冠心病心絞痛的防治中。叢敬等[9]研究表明，益氣活血類中藥對冠心病心絞痛病人預后的改善以及治療效果的提高均有顯著的影響；蔡常青等[10]深入探討了益氣活血中藥治療冠心病心絞痛的具體作用機制，發現可能與減弱病人血液黏滯度、抑制血栓形成、降低炎性因子的釋放以及對抗血小板聚集等相關。本研究篩選出丹參-黃芪-川芎配伍治療冠心病心絞痛的關鍵活性成分有4-亞甲丹參新酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、丹參酮ⅡA、丹參新酮、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、鼠尾草酚酮和槲皮素等。魏星等[11]研究表明，能作用于信號通路的槲皮素(來源于黃芪的有效組分)也具有明顯的改善炎癥反應和抑制細菌的作用。Wang等[12]研究表明，丹參新酮(來源于丹參中的有效組分)也已被證明具有降低炎癥反應的作用。

本研究結果表示，丹參-黃芪-川芎配伍治療冠心病心絞痛的關鍵靶點主要有ITGB3、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRA2A、PON1。生物功能主要涉及細胞炎癥反應、細胞增殖和凋亡、對雌二醇的反應、缺氧反應、基因表達、信號轉導、藥物反應、蛋白質磷酸化等生物學過程?；騃TGB3(GPⅡb/Ⅲa整合素)為最豐富的血小板特異性糖蛋白，有兩個亞單位異二聚體(αIIB鏈和β3鏈)，影響血栓形成，ITGB3作為配體受體，在血管壁細胞外基質與血小板相互結合的作用中至關重要，且能進一步促進血小板聚集[12]。血小板聚集是血管壁重塑以及形成血栓的關鍵步驟，在靜止血小板中，αIIbβ3糖蛋白的構象不允許配體結合，血小板的激活會引發糖蛋白細胞質的部分結構發生變化，從而使纖維蛋白原受體的結合部位被暴露，通過與其配體中的精氨酸、門冬氨酸、甘氨酸三肽發生結合，進而導致血小板聚集增加[13]。Kucharska-Newton等[14]研究表明，阿司匹林的低反應性可以通過ITGB3 基因rs5918(PlA)單核苷酸的多態性來進行預測。最常見的血小板多態性在GPⅢa蛋白(β3鏈)中，與RGD的結合序列位于同一區域，稱為PlA1/PlA2多態性或Leu33Pro多態性，這種遺傳變異與冠心病心絞痛終點之間的相關性已經受到專家學者的重視與關注。本研究結果發現，活性成分丹參酮ⅡA、4-亞甲丹參新酮可以直接作用于ITGB3，推測黃芪、丹參可能通過抗血栓功能發揮其治療作用。

本研究結果發現，環磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路、擴張型心肌病、神經活性配體-受體相互作用這3條通路可能與丹參-黃芪-川芎改善冠心病心絞痛相關。苑曉燁等[15]研究提示cGMP-PKG信號通路在抑制血管鈣化、保護心肌等方面作用效果明確。ADRA2B、ADRA2C、ADRA2A、ADRB1分別是cGMP-PKG信號通路富集的4個靶點。ADRA2A(基因腎上腺素能受體基因)、ADRA2C以及ADRA2B均為G蛋白偶聯受體的亞家族成員，趙善德[16]研究表明，上述受體與有氧耐力有一定的相關性，且在調控中樞神經系統方面起到關鍵的作用，主要是影響腎上腺素能神經元以及交感神經相關遞質的釋放。本研究中丹參酮ⅡA的DL以及OB均較高，并且可以直接作用于ADRA2A靶點，故推斷丹參酮ⅡA可能是發揮治療作用的一個主要組分。蘇梅等[17]研究表明，丹參酮ⅡA可升高血管內皮生長因子A(VEGF-A)mRNA水平，促進血管生成；可減少誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-6(IL-6)和環氧合酶-2(COX-2)等炎癥相關基因的表達，降低巨噬細胞炎癥介質的釋放和生成，從而減輕炎癥反應；還能通過調控細胞自噬以及凋亡保護心肌細胞。本研究發現，活性組分4-亞甲丹參新酮、丹參新酮、槲皮素、丹參酮ⅡA等能夠直接作用cGMP-PKG通路，說明這些活性成分也可能具有干預心肌細胞凋亡、改善心肌供血、調控炎性因子表達等作用。由此可見，丹參-黃芪-川芎可能通過調控多個通路改善冠心病心絞痛的發生發展。

本研究系統地探討了丹參-黃芪-川芎改善冠心病心絞痛的分子機制，整體描述了中藥與疾病的相互作用關系，發現丹參-黃芪-川芎中的槲皮素、丹參酮ⅡA可能是發揮效用的物質基礎，可通過調控多個靶點、通路發揮抑制血栓形成、對抗血小板活化、改善脂質代謝、減輕炎癥反應、減輕冠狀動脈微環境缺血缺氧狀態作用，進而穩定斑塊，從多角度、多層次參與到冠心病心絞痛的療效改善及組織修復。今后需補充完善相關的文獻，并設計相應的體內或體外實驗，以驗證本研究結果。

4 小 結

綜上所述，中醫藥組方的多靶點、多組分的特點在改善冠心病心絞痛等慢性復雜疾病方面凸顯出了其獨特的作用優勢。藥物的發現通常是從傳統藥物和臨床常用藥物中獲得啟示以及資源，中藥網絡藥理學是對中醫藥中關鍵活性組分與疾病相關的靶點在細胞網絡環境里的作用進行科學的探索分析，可以為科研和臨床工作者更好地了解中藥的協調性、整體性以及互補性等特征提供極大的幫助。Kim等[18]的研究表明，了解天然化合物/活性成分與人體代謝產物的結構類似性有助于解釋中藥的作用方式，進而提出并解釋了以天然化合物/活性成分為中心的觀點。希望這一鼓舞人心的工作能為中醫學研究帶來新的方法和新的見解，也希望中醫藥網絡藥理學能夠為發現新的多靶點、多組分的傳統中藥以及聯合用藥提供更多有益的參考和啟示。