Nrf2/HO-1、cAMP/PKA在TGR5減輕高糖、高脂誘導H9C2心肌細胞損傷中的作用機制

李 熠，馮 健

糖尿病是目前威脅人類健康的主要疾病，長期高血糖、有氧代謝降低的環境可引起心肌細胞代謝與鈣轉運發生紊亂，凋亡增多，從而引起心室重構、充血性心力衰竭，其發生發展機制較復雜，至今仍未清楚[1]。心肌細胞肥大病人在高糖等多種病理性刺激下可引起心肌細胞的表面積增加、細胞蛋白含量上升，促肥厚基因CARK(Cardiac Ankyrin Repeat Kinase)等表達水平升高，目前認為這種改變可能與相關受體異常表達有關[2-3]。G-蛋白偶聯膽汁酸受體1(G protein-coupled receptor for bile acids，TGR5或GPBAR1)屬于G-蛋白偶聯受體(GRCP)家族，其激活后可改善機體脂質、糖代謝紊亂與胰島素抵抗，減輕氧化應激，防止糖尿病、代謝綜合征等[4]。有研究發現，糖調節受損與2型糖尿病(T2DM)病人的血清TGR5水平較糖耐量正常人群下降，且在T2DM病人中男性血清TGR5較女性高，表明TGR5水平與糖代謝紊亂有一定關聯，但關于TGR5對心肌細胞損傷的影響研究甚少[5]。自胚胎大鼠心肌獲取的H9C2細胞系和原代乳鼠心肌細胞有高度相似性，常用于心血管疾病的基礎研究，本研究選擇大鼠H9C2心肌細胞進行培養，并分析激活TGR5對高糖、高脂誘導H9C2心肌細胞損傷的保護作用及信號轉導機制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9C2心肌細胞1株(武漢博士德微生物公司)，DMEM/F12培養基與多聚賴氨酸(Hyclone公司)，CO2培養箱(Thermo公司)，光學顯微鏡(Nikon公司)，-80 ℃冰箱(Thermo公司)，細胞培養皿(Costar公司)，低溫高速離心機(Thermo公司)，齊墩果酸(Sigma公司)，澳洲胎牛血清(BOVOGEN公司)，葡萄糖(Sigma公司)，棕櫚酸(Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(GIBICO公司)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma公司)，TGR5 shRNA(上海漢恒生物科技有限公司，慢病毒包裝)，核因子E2相關因子2(Nrf2)小干擾RNA分子(siRNA)慢病毒(吉凱基因科技有限公司)，血紅素加氧酶-1(HO-1)抑制劑鋅原卟啉(ZnPP，百靈威有限公司)，SQ22536(美國MCE公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Biosharp公司進口分公司)，活性氧熒光探針(DCFH-DA，Sigma公司)，小鼠橫紋肌輔肌動蛋白(α-actinin)及免疫組化試劑盒均購自武漢博士德微生物公司，胰酶、蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組 取生長狀態良好且處于對數生長期的H9C2心肌細胞，放置在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，于5%CO2及37 ℃培養箱中進行傳代培養，至細胞生長到約80%融合狀態時可用于實驗。將細胞分為對照組、高糖+高脂組、高糖+高脂+齊墩果酸組(TGR5受體激動劑)、干擾組[高糖+高脂+齊墩果酸+TGR5 shRNA(以TGR5干擾慢病毒包裝)]、Nrf2/HO-1組(高糖+高脂+齊墩果酸+Nrf2 siRNA病毒與ZnPP預處理)、環磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)組[高糖+高脂+齊墩果酸+SQ22536(cAMP抑制劑)預處理]。對照組單純采用DMEM培養基(含2%血清、5.5 mmol/L葡萄糖的低糖培養基)培養心肌細胞48 h；高糖+高脂組采用含2%血清、33.0 mmol/L葡萄糖加入到0.15 mmol/L棕櫚酸的DMEM培養基，培養心肌細胞48 h；高糖+高脂+齊墩果酸組采用含2%血清、33 mmol/L葡萄糖、0.15 mmol/L棕櫚酸、齊墩果酸30 μmol/L的DMEM培養基，培養心肌細胞48 h；干擾組先采用TGR5干擾慢病毒包裝將細胞感染，后加入33 mmol/L葡萄糖、0.15 mmol/L棕櫚酸，培養48 h；Nrf2/HO-1組以Nrf2 siRNA與ZnPP 10μmol/L預處理高糖+高脂+齊墩果酸(病毒感染處理48 h，方法同TGR5干擾慢病毒，ZnPP處理1 h)；cAMP/PKA組以SQ22536 100 μmol/L預處理高糖+高脂+齊墩果酸3 h。

1.2.2 心肌細胞形態變化過程 采用小鼠α-actinin抗體經免疫熒光法鑒定心肌細胞，在熒光顯微鏡下對心肌細胞的形態進行觀察。依次進行細胞爬片、細胞固定、透膜、封閉、抗體孵育、核染色(DAPI染液)、封片、拍照，帶綠色熒光為α-actinin(即為心肌細胞)，藍色為通過DAPI染色后的細胞核。

1.2.3 MTT法測定心肌細胞活性 于避光環境中向各待測孔中加20 μL的MTT工作液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中反應4 h，后將反應液棄去，各孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀低速震蕩10 min，選擇檢測波長為490 nm，測定此處熒光強度(OD)值，計算細胞活性率。

1.2.4 DCFH-DA測定心肌細胞內活性氧(ROS)水平 心肌細胞以5×105/mL密度接種于6孔板，每孔2 mL，心肌細胞貼壁培養72 h后可進行實驗。去除6孔板的檢測孔中心肌細胞培養液，加DCFH-DA(10 μmol/L)探針1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養箱內進行孵育，20 min后以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)泡洗3次，每次1 min。胰蛋白酶消化各孔心肌細胞，采用PBS對細胞輕柔吹洗，重復洗滌3次后進行離心以收集細胞，采用流式細胞儀檢測各組細胞DCFH-DA熒光強度。操作時嚴格依據試劑盒說明書進行。

1.2.5 應用圖像分析法測定各組心肌細胞表面積 將心肌細胞種在含載玻片的96孔板，采用冷D-Hanks液漂洗，以4%多聚甲醛進行固定，15 min后開始心肌細胞免疫熒光檢測并攝像，應用Image tool 3.0軟件對單個細胞的表面積進行測量，每張玻片測定5個視野，對從每個視野選取的10～15 個細胞進行測定，每組重復3次，取其平均值進行分析。

1.2.6 采用BCA法測定蛋白含量 收集6孔板中的各組細胞，制成細胞懸液，對每孔的心肌細胞數進行計數，沉淀細胞后加2～3倍體積細胞裂解液，促進心肌細胞膜溶解，在離心后吸取上清并采用BCA法對心肌細胞的蛋白含量進行檢測。

1.2.7 Nrf2、HO-1、PKA檢測 采用蛋白免疫印跡法(Westren Blot)檢測各組Nrf2、HO-1、PKA水平。按試劑盒的說明書進行心肌細胞核總蛋白提取。取一定量的蛋白樣品，加緩沖液后震蕩混勻，隨后在沸水中煮沸5 min使之變性，儲存于-20 ℃冰箱中備用或現用。將玻璃板清洗后晾干，分別制備分離膠(10%)和濃縮膠(5%)，在過夜后使用。取樣本50 μg加入樣本孔，樣本兩側均加4 μL的蛋白Marker，初始采用60 V電壓電泳，加樣本至分離膠時電壓增加到110 V，直至樣本達分離膠底部，結束電泳。后進行聚偏二氟乙烯(PVDF)轉膜，按海綿-轉膜濾紙-凝膠-PVDF膜-轉膜濾紙-海綿順序放置轉膜夾板，將轉膜夾板放至轉膜槽(黑對黑)，加入1×轉膜緩沖液。電流400 mA，冰冷條件下轉膜60 min，后進行封閉、一抗與二抗孵育，顯色，經凝膠圖像系統對圖像進行采集，利用Quantity One軟件對結果進行分析。

1.2.8 心肌損傷標志物測定 采用比色法測定肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)水平，高效液相色譜法(HPLC)測定cAMP。

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡心肌細胞變化 熒光顯微鏡下顯示，對照組心肌細胞核大，被染成淡藍色，內部有深藍色顆粒，高糖+高脂組心肌細胞染色強度較對照組增加，大部分細胞核固縮甚至破裂，被染成強藍色，而高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組大部分心肌細胞恢復正常，僅少許細胞被染成強藍色，干擾組染色強度較高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組增加。高糖+高脂組染色強度高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組染色強度則高于高糖+高脂組，而干擾組染色強度高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組。詳見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下各組心肌細胞變化 (A為對照組；B為高糖+高脂組；C為高糖+高脂+齊墩果酸組；D為干擾組；E為Nrf2/HO-1組；F為cAMP/PKA組)

2.2 6組心肌細胞活性、ROS、細胞表面積、蛋白含量比較 6組心肌細胞活性、ROS、細胞表面積、蛋白含量比較差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，高糖+高脂組心肌細胞活性率下降，ROS水平、心肌細胞表面積、心肌細胞蛋白含量增加；高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組心肌細胞活性率高于高糖+高脂組(P<0.01)，ROS水平、心肌細胞表面積、心肌細胞蛋白含量低于高糖+高脂組(P<0.01)，與高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組比較，干擾組心肌細胞活性率下降(P<0.01)，ROS水平、心肌細胞表面積及心肌細胞蛋白含量增加(P<0.01)，高糖+高脂組與干擾組心肌細胞活性率、ROS、細胞表面積、蛋白含量比較差異均無統計學意義(P>0.05)，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組心肌細胞活性率、ROS、細胞表面積、蛋白含量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2～圖5。

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖2 6組心肌細胞活性率比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖3 6組ROS水平比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖4 6組細胞表面積比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖5 6組蛋白含量比較

2.3 6組Nrf2、HO-1、PKA水平比較 6組Nrf2、HO-1、PKA水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。高糖+高脂組Nrf2、HO-1、PKA水平高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組Nrf2、HO-1、PKA水平均低于高糖+高脂組，干擾組Nrf2、HO-1、PKA水平均高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組，差異均有統計學意義(P<0.01)；高糖+高脂組與干擾組Nrf2、HO-1、PKA水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組Nrf2、HO-1、PKA水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖6～圖8及表1。

圖6 Western Blot法檢測Nrf2水平(1為對照組；2為高糖+高脂組；3為高糖+高脂+齊墩果酸組；4為干擾組；5為Nrf2/HO-1組；6為cAMP/PKA組)

圖7 Western Blot法檢測HO-1水平 (1為對照組；2為高糖+高脂組；3為高糖+高脂+齊墩果酸組；4為干擾組；5為Nrf2/HO-1組；6為cAMP/PKA組)

圖8 Western Blot法檢測PKA水平(1為對照組；2為高糖+高脂組；3為高糖+高脂+齊墩果酸組；4為干擾組；5為Nrf2/HO-1組；6為cAMP/PKA組)

表1 6組Nrf2、HO-1、PKA水平比較(±s)

2.4 6組CK、LDH、cAMP水平比較 6組CK、LDH、cAMP水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。高糖+高脂組、高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組、干擾組CK、LDH、cAMP水平高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組CK、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂組，干擾組CK、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組，差異均有統計學意義(P<0.01)；高糖+高脂組與干擾組CK、LDH、cAMP水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組CK、LDH、cAMP水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖9～圖11。

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖9 6組CK水平比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖10 6組LDH水平比較

與對照組比較，＊P<0.01；與高糖+高脂組比較，#P<0.01；與高糖+高脂+齊墩果酸組比較，△P<0.01；與Nrf2/HO-1組比較，☆P<0.01；與cAMP/PKA組比較，▲P<0.01。圖11 6組cAMP水平比較

3 討 論

糖尿病為胰島β細胞功能受損、導致胰島素缺乏或相對缺乏而導致的疾病，隨著人們生活與飲食習慣改變，該病發生率呈逐年升高趨勢，且發病有逐漸年輕化趨勢[6]。糖尿病相關的心血管并發癥是其主要死因，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)最終可發展為有癥狀的心力衰竭，因而明確糖尿病與心肌細胞損傷的關系有重要意義[7-8]。TGR5是一種新型G蛋白耦聯膽汁酸受體，可于激活狀態下經cAMP引導信號通路傳遞生物調節信號，激活下游轉錄因子，并調控下游基因的表達，與糖代謝及脂代謝有密切關聯[9]，研究發現，TGR5在膽管癌細胞(RBE)中呈高表達，可能與膽管癌的進展密切相關[10]，而激活的TGR5受體是否可經過cAMP活化而對糖尿病發揮抗氧化應激作用目前未見報道。

高糖、高脂誘發的氧化應激損傷為糖尿病心肌病重要發病機制，這可能與高糖、高脂在體內發生氧化導致ROS蓄積有關，因此，高糖、高脂可持續而穩定地產生ROS，從而有效地模擬糖尿病時細胞所處氧化環境。大鼠心肌細胞H9C2有可傳代、易培養、實驗穩定等特點，常用于心血管疾病的基礎研究。本研究采用高糖、高脂在體外誘導H9C2細胞產生氧化應激損傷，成功地建立氧化應激損傷模型。經熒光顯微鏡顯示，高糖+高脂組心肌細胞染色強度較對照組增加，而高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組大部分心肌細胞恢復正常，僅少許細胞被染成強藍色，干擾組染色強度較高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組增加，同時MTT法檢測也發現高糖+高脂+齊墩果酸組心肌細胞存活率高于高糖+高脂組，而干擾組心肌細胞存活率低于高糖+高脂+齊墩果酸組，這表明齊墩果酸可能經激活H9C2心肌細胞TGR5受體明顯減輕心肌細胞凋亡。既往也有研究表明，齊墩果酸可增加肝糖原的含量并使血清胰島素水平升高而降低血糖[11]。心肌對葡萄糖的利用減少及對脂肪酸攝取不平衡，能量的存儲發生改變，而由細胞器產生的氧化代謝增多，均可促使ROS產生增加，超出機體一定清除能力，無法及時清除ROS，繼而導致氧化應激引起的生理性變化，最終ROS直接損傷細胞DNA，誘導心肌細胞凋亡。本研究中高糖+高脂組ROS水平及心肌細胞表面積、心肌細胞蛋白含量高于對照組，而高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組心肌細胞活性率則高于高糖+高脂組，心肌細胞表面積、心肌細胞蛋白含量低于高糖+高脂組，在予以TGR5 siRNA干擾后，干擾組心肌細胞活性率下降，ROS水平及心肌細胞表面積、心肌細胞蛋白含量增加，這與早期有關學者的報道結果[12]相近，表明齊墩果酸激活TGR5后可使心肌細胞中ROS含量明顯降低，從而減少心肌細胞氧化應激損傷，避免高糖、高脂對H9C2心肌細胞的損傷，減少糖尿病對心臟造成的損害，這可能是糖尿病心肌病病人重要的藥物治療靶點。TGR5激活可通過抑制炎癥反應，減輕胰島素抵抗及高脂反應而緩解代謝炎癥[13]。Brighton等[14]研究發現，膽汁酸可將腸道內的分泌L細胞的多種信號通路激活，但胰升糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)分泌主要取決于TGR5是否活化，功能性TGR大部分分布在L細胞的后基底部，膽汁酸或TGR5激動劑可促進胰島素分泌需要通過腸道內皮的吸收過程。Molepo等[15]也發現，齊墩果酸對脂質代謝和葡萄糖轉運有一定影響；Li等[16]研究結果也提示TGR5可以減輕缺血再灌注誘導的線粒體功能障礙、細胞凋亡和炎癥反應，這些保護作用可能是通過蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3(protein kinase B/glycogen synthase kinase-3，AKT/GSK-3β)途徑實現的。因此，TGR5的激活對H9C2心肌細胞有保護作用，當然本研究也局限于體外細胞試驗，關于本研究結論有待后期進一步在體內動物實驗中進行驗證。

Ding等[17]的研究指出，TGR5受體可介導飲食誘導的肥胖小鼠在接受垂直袖狀胃切除術(vertical sleeve gastrectomy，VSG)后相應有益代謝作用消失，TGR5水平增加能明顯改善膽汁酸的水平及其組成，促使回腸及棕色脂肪組織中的TGR5信號增強，以較好地改善血糖和增加能耗。有研究發現，TGR5激活減輕高血糖誘導的H9C2細胞心肌肥厚，可經刺激PKA增強而使受磷蛋白(phospho-lamban，PLN)磷酸化，從而激活SERCA2a將鈣從胞漿中移至肌漿網，并使鈣調神經磷酸酶與NFAT信號通路降低，從而減輕高血糖所致的心肌細胞肥大[18]。Kumar等[19]認為，TGR可通過參與能量穩態的調節而抑制炎癥反應。這些研究均表明TGR5與糖尿病代謝密切相關。本研究中，高糖+高脂組Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平高于對照組，高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂組，干擾組Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齊墩果酸組、Nrf2/HO-1組、cAMP/PKA組，提示激活TGR5對高糖、高脂誘導H9C2心肌細胞損傷有保護作用，其信號轉導機制可能與Nrf2/HO-1及cAMP/PKA信號通路有密切關聯。在正常人體中，TGR5可表達于機體多種組織與細胞，生理狀態下TGR5作為跨膜蛋白其一端位于膜外感受器激動劑，另一端則位于胞漿中，可結合相應分子通過cAMP介導的信號途徑進行信號傳遞，啟動下游的轉錄因子[20]。TGR5激活后能較好控制血糖，調節血脂水平，從而使能量消耗提高并起到抗炎作用，有望成為較多代謝性疾病的藥物治療靶點[21]。一般而言，TGR5受體激活后，腺苷酸環化酶活性增強，引起cAMP水平升高，cAMP依賴的PKA磷酸化水平隨之升高，而PKA可導致AKT激活，促進GSK-3β磷酸化而引起GSK-3β失活[22-23]，因而推測TGR5受體激活后導致PKA激活，繼而促進AKT與GSK-3β磷酸化，引起Nrf2、Keapl解偶聯并轉位在細胞核中，同抗氧化反應元件結合，促進啟動子區域(AREs)調控的抗氧化酶基因轉錄與表達，如HO-1，繼而參與改善糖誘導的細胞功能紊亂，文星[24]的研究結果也表明，激活TGR5可明顯減輕G/GO模型誘導的心肌細胞氧化應激損傷，Nrf2/HO-1信號通路則可能參與TGR5減輕心肌細胞氧化應激損傷的過程。本研究可為心肌損傷的藥物治療靶點研究及藥物開發提供依據。

本研究結果表明，激活TGR5受體對高糖、高脂誘導H9C2心肌細胞有保護作用，其作用機制可能與Nrf2/HO-1、cAMP/PKA信號通路密切相關，有望成為改善糖尿病病人心肌損傷的藥物治療靶點。