替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對心肌梗死大鼠心肌復極時間、心肌細胞凋亡的影響

潘治峰，蘇長海，郭 敏

心肌梗死疾病的發(fā)生主要與冠狀動脈持續(xù)性缺血缺氧存在一定的關系，從而引起機體心肌組織出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象[1]。有研究認為，心肌梗死疾病早期階段，心肌細胞凋亡在其中發(fā)揮著主要的作用，初步表明在心肌梗死疾病早期，通過予以相關干預手段阻止心肌細胞凋亡，對于改善心肌梗死疾病的發(fā)展具有極其重要的作用[2-3]。替羅非班常被用于預防或者治療因冠狀動脈閉塞而導致的心肌梗死[4]。黃芪注射液的主要成分為黃芪，黃芪具有活血化瘀之功效，主要通過改善微循環(huán)、抑制血小板聚集，從而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用[5-7]。前期研究證實，心肌細胞復極障礙為心肌梗死疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的病理機制之一[8]。但是替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對心肌梗死病人心肌細胞復極障礙的作用尚且不明確。本研究主要探討替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對心肌梗死大鼠心肌復極時間、心肌凋亡的改善作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 替羅非班、黃芪注射液、利多卡因均購自北京和豐堂醫(yī)藥，青霉素、肝素、水合氯醛均購自蘇州啟航生物科技有限公司，一抗(1∶100 Bcl-2、Bax)購自Santa公司，細胞裂解液、10×封閉-洗滌緩沖液(TBST)均購自上海譜振生物科技有限公司。彩色多普勒超聲診斷儀(邁瑞醫(yī)療器械公司)、EGG TUNNEL心電儀(北京廣源達科技發(fā)展有限公司)、負壓抽吸器(天津市同業(yè)科技發(fā)展有限公司)、聚合酶鏈式反應(PCR)儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 實驗動物以及分組 選取SD(Sprague Dawley)大鼠30只，均為雌性，體質(zhì)量200～250 g，許可證號：scxk(京)2002-0003，環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度50%～60%。所有大鼠均采用自由飲水和進食的方式。隨機分為假手術組、對照組、藥物治療組，各組10只。假手術組大鼠在進行手術的過程中不進行其他任何處理；對照組大鼠在模型制作成功后，予以適量的生理鹽水；藥物治療組大鼠在模型制作成功后，予以替羅非班聯(lián)合黃芪注射液進行干預，黃芪注射液劑量為1.2 g/(kg·d)，替羅非班劑量為5 mg/(kg·d)。

1.3 動物模型的制作[9]對各組大鼠進行麻醉處理，同時予以消毒。在大鼠軟骨環(huán)間進行切開操作，鈍性分離，再將大鼠的氣管完全暴露處理，并予以氣管插管。在小鼠胸部肋下做切口，分離筋膜，暴露胸骨，同時暴露心臟組織，分離心包，采用棉簽分離胸腺組織，準確尋找左冠狀靜脈，再以左冠狀靜脈作為標志，采用7-0縫線進行結扎處理，同時觀察心肌組織變化情況，手術結扎成功的標志是大鼠存在兩個肢體導聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高0.2 mV。觀察心臟是否出現(xiàn)出血，如果無出血，清洗胸腔，并進行縫合處理，關胸前行負壓抽吸。術后如果出現(xiàn)心肌梗死、心律失常癥狀，需要予以適量的利多卡因注射液。約30 min后，觀察大鼠情況，如果出現(xiàn)吞咽動作，立即拔除氣管，逐層縫合組織。同時術后予以抗菌藥物青霉素預防感染。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 心功能檢測 造模結束后，于6周末，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測心臟射血分數(shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。同時經(jīng)主動脈取血，靜置30 min后分離血漿。

1.4.2 心電圖檢測 各組大鼠進行干預以后，再將各組大鼠置于EGG TUNNEL心電儀上檢測，及時記錄大鼠6導聯(lián)體表心電圖，采用ECG Auto分析數(shù)據(jù)，主要指標包括PR、QRS、QT、QTc間期。

1.4.3 心臟標本的獲取并進行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察 脫臼處死大鼠，取各組大鼠心肌組織，進行HE染色，觀察各組心肌組織的病理學變化情況。

1.4.4 心肌細胞動作電位 模型制作成功并進行藥物干預后，開始檢測各組大鼠心肌細胞動作電位，首先腹腔注射適量的肝素溶液，20 min后再予以適量的水合氯醛溶液，獲取各組大鼠心臟、主動脈，清洗，灌流，再灌注適量的消化溶液，10 min后使其達到心室松軟。再取左室心肌組織，剪碎，吹打，過濾，分離心肌細胞，采用電流鉗模式檢測心肌細胞動作電位，設置參數(shù)：電阻為2～3 MΩ，灌流液濃度為1.8 mmol/L，整個實驗過程均在室溫的環(huán)境下進行。電阻>2.0 GΩ以后，采用負壓抽吸器進行抽吸，-80 mV時，同樣采用電流鉗模式給予電流，并誘發(fā)相關電位的發(fā)生，記錄以下指標，即靜息電位(RP)、動作電位幅值(APA)、動作電位復極至50%的時程(APD50)及動作電位復極至90%的時程(APD90)。

1.4.5 脫氧核酸轉移酶標記技術(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡指數(shù)(C-PARP) 取上述心肌組織，并進行固定，脫水，石蠟包埋，切片，于烤箱烤10 min，再予以適量的二甲苯、乙醇溶液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進行清洗，此后步驟根據(jù)試劑盒說明書操作，結束后，隨機取梗死區(qū)域10個視野，計算C-PARP。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達 取上述心肌組織，胰酶溶液消化，離心，制成單細胞懸液，進行培養(yǎng)，細胞接種以后，觀察細胞生長，貼壁到90%左右開始檢測其蛋白表達。先通過適量的PBS清洗，再通過適量的細胞裂解液進行培養(yǎng)一段時間，開始進行離心操作，將下層沉淀清理干凈，取上層溶液。開始進行蛋白定量操作，結束以后，將蛋白樣本放置在-20 ℃冰箱內(nèi)，取出蛋白樣本，進行凝膠電泳，電轉移，過夜，分別加入適量的一抗(1∶100 Bcl-2、Bax)、二抗進行孵育，再通過適量的10×封閉-洗滌緩沖液清洗，曝光、顯影、成像。調(diào)整曝光時間，確定最佳的條帶。

1.4.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測心肌組織中Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA水平表達 從上述各組細胞中提取總RNA，逆轉錄，PCR擴增。95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。β-actin為標準計算2-△△Ct。詳見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 3組大鼠心功能和心電圖指標比較 與對照組比較，藥物治療組和假手術組EF、FS升高(P<0.05)，LVESD、LVEDD降低(P<0.05)，藥物治療組EF、FS、LVESD、LVEDD與假手術組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，藥物治療組和假手術組QRS、QT、QTc明顯縮短(P<0.05)，藥物治療組QRS、QT、QTc與假手術組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組PR比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 3組大鼠心功能比較(±s)

表3 3組大鼠心電圖指標比較(±s) 單位：ms

2.2 3組大鼠心肌細胞動作電位比較 3組APD50、RP、APA比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與對照組比較，藥物治療組和假手術組APD90縮短(P<0.05)，藥物治療組APD90與假手術組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 3組大鼠動作電位曲線圖

表4 3組大鼠心肌細胞動作電位比較(±s)

2.3 3組大鼠心肌細胞HE染色結果 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞排列比較有規(guī)則，并且細胞核明顯，核大小比較均勻；對照組大鼠心肌細胞排列雜亂無章，其細胞核附近具有明顯的空泡性病變，細胞具有明顯的壞死現(xiàn)象，并伴有明顯的炎細胞浸潤；藥物治療組大鼠心肌細胞與對照組比較，改善效果顯著。詳見圖2。

圖2 3組大鼠心肌細胞HE染色結果(a為假手術組；b為對照組；c為藥物治療組)

2.4 3組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax蛋白、C-PARP比較 Western Blot檢測結果顯示，假手術組Bcl-2/Bax蛋白表達最高，藥物治療組次之，對照組最低，藥物治療組、假手術組Bcl-2/Bax蛋白表達高于對照組(P<0.05)，藥物治療組、假手術組Bcl-2/Bax蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TUNEL染色法檢測結果顯示，假手術組C-PARP最低，藥物治療組次之，對照組最高，藥物治療組、假手術組C-PARP低于對照組(P<0.05)，藥物治療組C-PARP高于假手術組(P<0.05)。詳見圖3、圖4及表5。

圖3 Western Blot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(a為假手術組；b為對照組；c為藥物治療組)

圖4 Western Blot檢測C-PARP(a為假手術組；b為對照組；c為藥物治療組)

0.05。

2.5 3組大鼠心肌組織Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達比較 qRT-PCR檢測結果顯示，藥物治療組和假手術組心肌組織中Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達均低于對照組(P<0.05)，藥物治療組和假手術組心肌組織中Fas mRNA、Fas-L mRNA表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物治療組心肌組織中p53 mRNA表達低于假手術組(P<0.05)。詳見表6。

表6 3組大鼠心肌組織Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達比較(±s)

3 討 論

本研究主要探討替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對心肌梗死大鼠心肌復極時間、心肌凋亡的改善作用及可能存在的作用機制。制作心肌梗死動物模型，從動物水平進行研究，首先觀察了各組大鼠心功能和心電圖的改善情況，結果顯示，與對照組比較，藥物治療組大鼠心功能和心電圖均具有明顯的改善效果，且與假手術組大鼠比較，差異均無統(tǒng)計學意義。黃芪注射液發(fā)揮作用的途徑主要通過清除氧自由基，進一步減少相關脂質(zhì)過氧化物，改善大鼠血管內(nèi)皮細胞的功能，從而對其心肌發(fā)揮保護作用，以及對心肌超微結構和超氧化物歧化酶(SOD)活性發(fā)揮保護作用，縮小心肌梗死面積，最終發(fā)揮改善心功能的效果；另外結合替羅非班藥物，效果更加明顯，因為替羅非班可通過控制心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平發(fā)揮對心功能的改善作用，另外還可以通過促進內(nèi)皮細胞進一步分泌一氧化氮，從而改善局部灌注，減少心肌灌注損傷，最終發(fā)揮對心功能的改善作用[10-12]。

有研究表明，存在多種因素均能夠?qū)е滦募蜆O障礙的產(chǎn)生，如蛋白酶的激活、鈣轉運障礙等，從而進一步參與心肌梗死病理過程[13]。本研究主要通過檢測心肌細胞動作電位預測心肌復極障礙的產(chǎn)生，結果顯示，3組APD50、RP、APA比較差異均無統(tǒng)計學意義，與對照組比較，藥物治療組和假手術組APD90明顯縮短，藥物治療組和假手術組APD90比較差異無統(tǒng)計學意義，表明替羅非班聯(lián)合黃芪注射液能夠在一定程度上縮短心肌細胞復極時間，從而進一步改善心肌細胞復極障礙。分析其原因：替羅非班聯(lián)合黃芪注射液可能通過抑制L型鈣通道蛋白磷酸化過程，進一步抑制L型鈣電流發(fā)生重構；也可能通過抑制肌漿網(wǎng)鈣轉運蛋白磷酸化過程，進一步對心肌細胞鈣轉運過程產(chǎn)生影響，抑制復極期心肌細胞內(nèi)鈣離子水平，最終減少鈉鈣交換體的電流；也可能通過抑制晚鈉通道磷酸化過程，從而進一步降低復極3期的電流[14-16]。另外也有研究認為，心肌梗死模型中鉀通道蛋白水平異常下降，其密度減小，引起外向電流明顯減小[17]，從側面進一步論證上述猜測。

Bcl-2/Bax比值主要參與心肌細胞凋亡[18]。Bcl-2主要發(fā)揮抑制細胞凋亡作用，Bax主要促進細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值一定程度上決定了細胞區(qū)域是否是凋亡或者存活狀態(tài)[19]。有研究認為，心肌梗死過程中心肌細胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值明顯下降[20]。Fas、Fas-L之間可相互作用，進一步激活Caspases-8、Caspases-3信號通路的活性程度，從而促進心肌細胞凋亡[21]。本研究進一步探討替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的改善作用，結果顯示，假手術組Bcl-2/Bax蛋白表達最高，藥物治療組次之，對照組最低；假手術組C-PARP最低，藥物治療組次之，對照組最高；藥物治療組和假手術組心肌組織Fas mRNA、Fas-L mRNA、p53 mRNA表達低于對照組。分析其原因：替羅非班聯(lián)合黃芪注射液可能通過介導p53通路途徑，抑制心肌細胞發(fā)生凋亡，也可能通過抑制Caspases-8、Caspases-3信號通路的活性程度，抑制心肌細胞凋亡[22-24]。與Vasudevan等[25]的研究結果具有一致性。

綜上所述，替羅非班聯(lián)合黃芪注射液對心肌梗死大鼠心肌復極時間、心肌凋亡具有明顯的改善作用，其中心肌凋亡的改善作用與下調(diào)心肌細胞凋亡蛋白Fas、Fas-L、p53、Bcl-2/Bax表達有關，心肌復極時間的改善作用與晚鈉通道磷酸化抑制作用有關。替羅非班聯(lián)合黃芪注射液能夠?qū)е滦募〖毎麆幼麟娢粡蜆O時間縮短，抑制異常觸發(fā)活動的產(chǎn)生，但是具體可能存在的作用還需要進一步驗證。