黃建猷 胡筱希 譚曉 屈信成 陸國壽 黃周鋒



中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408(2021)21-2624-07
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.11
摘 要 目的:建立瑤藥消瘤藤的質量標準,為其質量控制提供參考。方法:采集10批廣西產消瘤藤藥材,觀察其性狀,并對其根、莖的橫切面以及藥材粉末進行顯微鑒別;以7-羥基香豆素為指標成分建立該藥材的薄層色譜(TLC)鑒別方法;測定該藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物;采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定該藥材中茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量。結果:消瘤藤根和莖表面皺紋明顯、質硬,氣微、味微苦,橫切面有分泌細胞和針晶細胞分布;藥材粉末中有草酸鈣針晶、草酸鈣方晶、石細胞和淀粉粒。TLC結果顯示,供試品色譜中,在與7-羥基香豆素對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。10批藥材的水分測定結果為9.1%~11.8%,總灰分為3.6%~6.7%,酸不溶性灰分為0.10%~0.44%,醇溶性浸出物為8.9%~14.0%。茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的質量濃度分別在6.088~182.640、1.568~47.040、1.096~32.880 μg/mL范圍內與其對應色譜峰峰面積成良好的線性關系(r均不低于0.999 7);平均加樣回收率分別為99.47%、101.07%、99.89%(RSD均小于2%);精密度、穩定性(24 h)、重復性、耐用性試驗的RSD均小于2%。茵芋苷等3種待測成分的含量分別為1.337~9.534、0.348~2.236、0.083~1.088 mg/g。結論:初步擬定消瘤藤中水分不得過12.0%、總灰分不得過7.0%、醇溶性浸出物不得少于8.0%、茵芋苷含量不得少于1.30 mg/g、7-羥基香豆素含量不得少于0.30 mg/g、7-羥基-8-甲氧基香豆素含量不得少于0.06 mg/g。
關鍵詞 瑤藥;消瘤藤;質量標準;薄層色譜法;高效液相色譜法;顯微鑒別;性狀鑒別;茵芋苷;7-羥基香豆素;7-羥基-8-甲氧基香豆素
ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To establish the quality standard of Yao medicine Pileostegia tomentella,and to provide reference for its quality control. METHODS:Totally 10 batches of P. tomentella were collected from Guangxi area. The properties of P. tomentella were observed and microscopic identification was conducted for the transverse section of its stems, roots and powder.TLC method was established by using 7-hydroxycoumarin as reference. The contents of water, total ash, acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract in P. tomentella were determined. The contents of skimmin,7-hydroxycoumarin and 7-hydroxy-8- methoxycoumarin in P. tomentella were determined by HPLC. RESULTS: The root and stem surface of P. tomentella possessed obvious wrinkles, hard texture, slight smell and bitter taste, and there were secretory cells and needle crystal cells in the cross section. The medicinal powder contained calcium oxalate needle crystal, calcium oxalate square crystal, sclerotic cell and starch granules. The results of TLC showed that the spots of the same color were found in the corresponding positions of chromatograms of test samples and 7-hydroxycoumarin control. In the 10 batch of P. tomentella,the contents of water were 9.1%-11.8%; those of total ash were 3.6%-6.7%; those of acid-insoluble ash were 0.10%-0.44%; those of alcohol-soluble extract were 8.9%-14.0%.The linear range of skimmin, 7-hydroxycoumarin and 7-hydroxy-8-methoxycoumarin were 6.088-182.640, 1.568-47.040 and 1.096- 32.880 μg/mL (all r not less than 0.999 7). The average recoveries were 99.47%,101.07% and 99.89%(RSD were all less than 2%). RSDs of precision, stability (24 h), reproducibility and durability tests were all lower than 2%. The contents of 3 components such as skimmin were 1.337-9.534, 0.348-2.236, 0.083-1.088 mg/g, respectively. CONCLUSIONS: It is preli- minarily proposed that the content of water in P. tomentella is not more than 12.0%; that of total ash is not more than 7.0%; that of alcohol-soluble extract is not less than 8.0%; that of skimmin is not less than 1.30 mg/g; that of 7-hydroxy- coumarin is not less than 0.30 mg/g; that of 7-hydroxy-8-methoxycoumarin is not less than 0.06 mg/g.
KEYWORDS? ?Yao medicine;Pileostegia tomentella;Quality standard;TCL;HPLC;Microscopic identification; Character identification; Skimmin; 7-hydroxycoumarin;7-hydroxy-8-methoxycoumarin
消瘤藤又名星毛冠蓋藤、腫瘤藤等,為虎耳草科植物星毛冠蓋藤Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.的干燥根和莖,被《中國高等植物圖鑒(第二冊)》《中國植物志(第三十五卷)》《中華本草(第四冊)》《廣西植物志(第二卷)》《廣西藥用植物名錄》等收載[1-5],且已被列為《廣西壯族自治區瑤藥材質量標準(第二卷)》擬收錄品種。該藥主要分布于我國廣西、浙江、江西、福建、湖南、廣東、貴州等地[3],在廣西主要分布于上林、防城、靈山、賀州、鐘山、平樂、龍勝等地[5]。據文獻記載,消瘤藤主要含有香豆素類、苯丙素類、環烯醚萜類和揮發油類等化學成分,具有祛風除濕、散瘀止痛、消腫解毒的功效[6-9]。藥理研究表明,該藥具有抗腫瘤、抗氧化等活性[10-13]。廣西民間瑤醫多年的臨床實踐證明,該藥具有抗腫瘤作用,可用于治療多種惡性腫瘤[6-8,14]。在其質量控制方面,李耀燕等[14]對廣西產消瘤藤的生藥學進行了研究;盧森華等[15]對不同產地消瘤藤藥材的質量進行了評價;李詠梅等[16]對消瘤藤不同藥用部位的化學成分進行了高效液相色譜(HPLC)分析;肖冰梅等[17]對湖南產消瘤藤的水分、灰分、浸出物等進行了研究,等等。但上述研究都相對簡單且不夠系統,不能有效滿足對消瘤藤藥材的質量控制;同時,由于生長環境的不同,不同產地的消瘤藤藥材在質量、形態及組織結構等方面可能會有所不同。因此,有必要建立系統而完善的消瘤藤質量標準。鑒于此,本研究收集了廣西不同產地的消瘤藤樣品,建立了快速、簡便、準確、有效的質量分析方法,旨在為消瘤藤藥材的質量標準研究提供科學依據。
1 材料
1.1 主要儀器
本研究所用的主要儀器有E2695型HPLC儀(美國Waters公司)、1260型HPLC儀(美國Agilent公司)、RM2245型切片機(德國Leica公司)、Ni-U型生物顯微鏡(日本Nikon公司)、XS205型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、KS-3200DE型液晶超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)、ZF1-Ⅱ型紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)、SX2-23-10型箱式電阻爐(沈陽市節能電爐廠)、AK-400A型搖擺式粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)、硅膠G薄層色譜(TLC)板(青島海洋化工有限公司,批號20190408)、Milli-Q型超純水系統(美國Millipore公司)。
1.2 主要藥品與試劑
本研究所用的主要藥品與試劑有7-羥基-8-甲氧基香豆素對照品、7-羥基香豆素對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號分別為X14O10L100104、A04A6L1,純度≥98%),茵芋苷對照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號wkq19011409,純度≥98%),乙腈(色譜純,美國Merck公司),磷酸、乙醇、甲醇(分析純,廣東光華科技股份有限公司),氯仿、丙酮(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)。
10批消瘤藤藥材采自廣西各個產地,經廣西壯族自治區中醫藥研究院黃云峰副研究員鑒定,均為虎耳草科植物星毛冠蓋藤P. tomentella Hand.-Mazz.的干燥根和莖。取部分藥材,洗凈,切片,備用。10批消瘤藤藥材樣品的來源信息如表1所示。
2 方法與結果
2.1 性狀鑒別
本品根為圓柱形,表面呈灰褐色,具縱皺紋及支根痕,直徑0.2~1 cm;質硬,難折斷,斷面皮部呈棕褐色,木部呈灰白色。莖為圓柱形,表面呈灰褐色,具縱皺紋及細小氣生根痕,老莖栓皮有明顯的不規則溝槽,直徑0.6~3 cm;質硬,難折斷,斷面皮部呈灰褐色,木部呈黃白色,有細密的放射狀紋理,中部有灰黃色髓或中空。其飲片多為斜切片,厚0.2~0.8 cm,直徑0.5~4 cm。本品氣微,味微苦。消瘤藤的性狀鑒別圖如圖1所示。
2.2 顯微鑒別
2.2.1 根橫切面的顯微鑒別 本品根有木栓層細胞5~10列,呈扁方形或類圓形。皮層內散布著分泌細胞和針晶細胞,部分分泌細胞內含棕黃色分泌物質。韌皮部較窄,可見分泌細胞和針晶細胞分布。木質部導管多單個徑向排列,直徑15~86 μm;木射線細胞1~3列;部分薄壁細胞內含淀粉粒或棕黃色分泌物質。消瘤藤根橫切面的顯微鑒別圖如圖2所示。
2.2.2 莖橫切面的顯微鑒別 本品莖有木栓層細胞3~10列,呈長方形或類圓形。皮層外側有2~3層石細胞斷續排列成環,皮層和韌皮部可見分泌細胞和針晶細胞分布。木質部寬廣,導管多為單個徑向排列,直徑18~46 μm;木射線細胞有1~3列。髓部外側細胞壁較厚,中部細胞壁較薄,可見分泌細胞和針晶細胞分布,且分泌細胞內含棕黃色分泌物質。消瘤藤莖橫切面的顯微鑒別圖如圖3所示。
2.2.3 藥材粉末的顯微鑒別 本品粉末呈棕黃色。纖維成束或分離,先端圓鈍或折斷;胞腔較寬,直徑13~36 μm。石細胞較多,單個或數個相連,呈多角形、類圓形、長橢圓形等;細胞壁較厚;孔溝明顯,長40~105 μm,寬15~55 μm。草酸鈣針晶較多,散在或存在于薄壁細胞中。草酸鈣柱晶粗細和長短不一,直徑寬至5 μm,長45~180 μm。草酸鈣方晶較少,直徑8~16 μm。淀粉粒為單粒或復粒,復粒由2~5個分粒組成,呈圓形、半圓形或類圓形;臍點呈點狀或裂縫狀,直徑4~13 μm。梯紋導管少見,直徑18~31 μm。消瘤藤藥材粉末的顯微鑒別圖如圖4所示。
2.3 TLC鑒別
取本品粉末(過40目篩,下同)2 g,加95%乙醇50 mL回流提取1.5 h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。另取7-羥基香豆素對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。參照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0502 TLC法”操作[18]:吸取上述2種溶液各5~10 μL,分別點于同一硅膠G TLC板上,以氯仿-丙酮(9.5 ∶ 0.5,V/V)為展開劑,在溫度30 ℃、相對濕度68%的條件下展開;取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果可見,供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。消瘤藤的TLC鑒別圖如圖5所示。
2.4 水分測定
參照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0832水分測定法第二法”對消瘤藤藥材中的水分進行測定[18],每批樣品平行測定3次。結果顯示,10批樣品的水分為9.1%~11.8%,平均值為10.3%(RSD=8.6%,n=3)。考慮到藥材來源差異,本研究以略高于最高測定值設限,初步擬定消瘤藤藥材中水分不得過12.0%。消瘤藤藥材中水分的測定結果如表2所示。
2.5 總灰分和酸不溶性灰分測定
參照2020年版《中國藥典》(四部)通則“2302灰分測定法”對消瘤藤藥材中的灰分進行測定[18],每批樣品平行測定3次。結果顯示,10批樣品的總灰分測定值為3.6%~6.7%,平均值為4.9%(RSD=21.5%,n=3)。考慮到藥材來源差異,本研究以略高于最高測定值設限,初步擬定消瘤藤藥材中總灰分不得過7.0%。酸不溶性灰分測定值為0.10%~0.44%,平均值為0.22%(RSD=48.9%,n=3)。鑒于實測值均較小,故暫不設定其酸不溶性灰分的限度。消瘤藤藥材中總灰分和酸不溶性灰分的測定結果如表2所示。
2.6 醇溶性浸出物測定
消瘤藤中富含香豆素及其苷類成分[7-9],這些成分溶于乙醇,故本研究考慮將醇溶性浸出物作為該藥材質量控制的指標之一;同時,考慮到熱浸法可以節省時間,提取率也高,故采用熱浸法進行測定,具體方法參照2020年版《中國藥典》(四部)通則“2201浸出物測定法”項下的“醇溶性浸出物測定法”[18],每批樣品平行測定3次。結果顯示,10批樣品的醇溶性浸出物測定值為8.9%~14.0%,平均值為10.8%(RSD=12.5%,n=3)。考慮到藥材來源差異,本研究以略低于最低測定值設限,初步擬定消瘤藤藥材中醇溶性浸出物不得少于8.0%。消瘤藤藥材中醇溶性浸出物的測定結果如表2所示。
2.7 茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量測定
2.7.1 溶液的制備 (1)供試品溶液的制備:取樣品粉末約0.5 g,精密稱定,置于具塞三角瓶中,精密加入80%甲醇25 mL,稱定質量,超聲(功率180 W,頻率40 kHz)處理40 min;放至室溫,再次稱定質量,用80%甲醇補足減失的質量,搖勻,以0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。(2)混合對照品溶液的制備:取茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素對照品各適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含茵芋苷304.4 μg、7-羥基香豆素78.4 μg和7-羥基-8-甲氧基香豆素54.8 μg的溶液,作為混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇制成每1 mL含茵芋苷30.44 μg、7-羥基香豆素7.84 μg和7-羥基-8-甲氧基香豆素5.48 μg的溶液,作為混合對照品溶液。
2.7.2 色譜條件與系統適用性試驗 以Waters XBridge? C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)為色譜柱,以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動相進行梯度洗脫(0~45 min,5%A→30%A;45~46 min,30%A→5%A;46~60 min,5%A);檢測波長為320 nm;流速為1 mL/min;柱溫為25 ℃;進樣體積為10 μL。
分別精密吸取“2.7.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液(編號S1)和空白對照(80%甲醇)適量,按上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖(圖6)。結果顯示,茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的分離度均大于1.5,理論板數均不低于8 000;空白對照不干擾測定。
2.7.3 線性關系考察 分別精密吸取“2.7.1(2)”項下混合對照品貯備液0.2、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋并定容,搖勻,得茵芋苷(6.088、18.264、30.440、60.880、121.760、182.640 μg/mL)、7-羥基香豆素(1.568、4.704、7.840、15.680、31.360、47.040 μg/mL)、7-羥基-8-甲氧基香豆素(1.096、3.288、5.480、10.960、21.920、32.880 μg/mL)系列混合對照品溶液,按“2.7.2”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)、待測成分的質量濃度為橫坐標(X)進行線性回歸,結果如表3所示。由表3可知,3種待測成分在各自的質量濃度范圍內與峰面積成良好的線性關系。
2.7.4 精密度試驗 取“2.7.1(2)”項下混合對照品溶液適量,按“2.7.2”項下色譜條件連續進樣測定6次,記錄峰面積。結果顯示,茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素峰面積的RSD分別為0.23%、0.43%、0.36%(n=6),表明儀器精密度良好。
2.7.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液(編號S1)適量,按“2.7.2”項下色譜條件分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時進樣測定,記錄峰面積。結果顯示,茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素峰面積的RSD分別為1.21%、1.24%、1.34%(n=6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。
2.7.6 重復性試驗 取同一批樣品粉末(編號S1)約0.5 g,共6份,精密稱定,分別按“2.7.1(1)”項下方法制備供試品溶液,再按“2.7.2”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,以外標法計算樣品含量。結果顯示,茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的平均含量分別為6.061、1.585、1.086 mg/g,RSD分別為0.71%、1.05%、1.48%(n=6),表明本方法重復性良好。
2.7.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的樣品粉末(編號S1)約0.25 g,共6份,精密加入“2.7.1(2)”項下混合對照品貯備液5 mL,按“2.7.1(1)”項下方法制備供試品溶液,再按“2.7.2”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結果如表4所示。由表4可知,本方法準確度良好。
2.7.8 耐用性試驗 (1)不同色譜柱:分別采用Waters XBridge? C18、Waters SunFire? C18和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 等3種不同色譜柱(規格均為250 mm×4.6 mm,5 μm)測定同一供試品溶液(編號S1)中茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量,其余條件同“2.7.2”項。結果顯示,3種待測成分的平均含量依次為6.045、1.601、1.097 mg/g,RSD分別為1.24%、1.16%、1.35%(n=3)。(2)不同HPLC儀:分別采用Waters e2695和Agilent 1260兩臺不同HPLC儀測定同一供試品溶液(編號S1)中茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量,其余條件同“2.7.2”項。結果顯示,3種成分的平均含量依次為6.055、1.594、1.088 mg/g,RSD分別為0.94%、1.08%、1.52%(n=2)。上述結果均表明本方法耐用性良好。
2.7.9 樣品含量測定 取10批消瘤藤藥材樣品,分別按“2.7.1(1)”項下方法制備供試品溶液,再按“2.7.2”項下色譜條件進樣測定,計算峰面積,以外標法計算各批藥材中茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量,每批樣品平行測定3次,結果如表5所示。
由表5可知,10批樣品中茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量分別為1.337~9.534、0.348~2.236、0.083~1.088 mg/g,平均含量分別為4.295、1.073、0.417 mg/g。考慮到藥材來源差異,本研究以略低于含量最低值設限,初步擬定本品中茵芋苷的含量不得少于1.30 mg/g、7-羥基香豆素的含量不得少于0.30 mg/g、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量不得少于0.06 mg/g。
3 討論
3.1 TLC鑒別條件的選擇
筆者前期分別考察了不同展開劑[氯仿-乙酸乙酯(9 ∶ 1,V/V)、氯仿-丙酮(9 ∶ 1,V/V)、氯仿-丙酮(9.5 ∶ 0.5, V/V)和正己烷-正丙醇(9 ∶ 1,V/V)]、不同觀察方法(紫外光燈254 nm、紫外光燈365 nm、日光)、不同展距(8、10、12 cm)對TLC鑒別結果的影響。結果顯示,以氯仿-丙酮(9.5 ∶ 0.5,V/V)為展開劑、展距為8 cm、在紫外光燈365 nm條件下觀察到的分離效果較好,主斑點的比移值(Rf)適宜,且斑點清晰。
3.2 HPLC法供試品溶液制備方法的選擇
筆者在前期研究中對消瘤藤藥材超聲提取和回流提取的結果進行了對比,發現回流提取的樣品含量略高于超聲提取,但回流提取所得雜質相對較多,同時考慮到超聲提取比較方便,因此最終選擇超聲提取法來提取樣品。在提取溶劑上,筆者曾對甲醇、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、80%甲醇的提取效果進行比較,發現采用80%甲醇提取所得樣品含量較高,因此選擇80%甲醇作為提取溶劑。在提取時間上,筆者發現提取40 min后樣品含量無明顯增加,故選擇提取時間為40 min。
3.3 HPLC條件的選擇
筆者通過HPLC-二極管陣列檢測器在210~400 nm波長范圍內進行全波長掃描,可得茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的最大吸收波長分別為318、324、321 nm,其中在320 nm波長下檢測時各色譜峰的分離度均大于1.5且基線平穩,故綜合各方面因素考慮,最終選擇320 nm作為檢測波長。筆者前期還對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液等流動相體系進行了比較,發現以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相所得色譜峰的分離度和峰形較好,故選擇其作為本研究中HPLC法的流動相。
3.4 HPLC法指標成分的選擇
根據文獻報道,從消瘤藤藥材中可分離得到茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素等香豆素類化合物[6-8]。現代藥理學研究發現,茵芋苷可治療腎功能不全[19];7-羥基香豆素對人膀胱癌細胞系E-J細胞株的增殖具有抑制作用[20],并具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復活線蟲致死活性等[21];7-羥基-8-甲氧基香豆素能抑制丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶的活性[22]。三者的藥理活性與消瘤藤散瘀止痛、消腫解毒的功效相符,故本研究選其作為指標性成分進行含量測定。
綜上所述,本研究建立了瑤藥消瘤藤的性狀及顯微鑒別方法,以7-羥基香豆素為指標成分的TLC鑒別方法,以及同時測定藥材中茵芋苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素含量的HPLC法,制訂了該藥材中水分、總灰分、醇溶性浸出物和上述3種有效成分的檢測限度,所建標準可為消瘤藤藥材的質量控制提供參考。但本研究只采集了廣西各產地藥材,且時間跨度較長、樣本范圍較為局限,后續研究還將采集其他省份藥材進行研究,以建立更加完善的藥材質量標準。
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(收稿日期:2021-04-06 修回日期:2021-09-22)
(編輯:胡曉霖)