七味葡萄散對哮喘模型大鼠哮喘癥狀和肺部損傷的改善作用

王 錦 馬瑋瑋 劉 燕 劉小玲 姜現瑞 張娟娟

（河西學院醫學院，甘肅 張掖 734000）

支氣管哮喘（Bronchial asthma，簡稱哮喘）是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，在我國哮喘的患病率呈快速上升趨勢［1］，嚴重影響患者的生活質量.中醫藥在治療哮喘方面歷史悠久，臨床經驗豐富.七味葡萄散（Qiwei grape powder）系蒙古族驗方，具有清肺、止咳、定喘等功能［2］.本研究采用卵蛋白致支氣管哮喘大鼠模型，應用七味葡萄散對哮喘模型大鼠進行灌胃干預治療，觀察大鼠行為學表現，并在光鏡下觀察肺部損傷的組織病理學改變，評價七味葡萄散對哮喘模型大鼠肺部損傷的影響，以進一步探討七味葡萄散治療哮喘的作用機制.

1 材料

1.1 藥物：白葡萄干15g，石膏12.5g，香附11.5g，石榴11g，甘草9g，紅花5.5g，肉桂5.5g.制法除白葡萄干外，其余石膏等六味粉碎成粗粉，加白葡萄干，粉碎，烘干，再粉碎成細粉，過篩，混勻，即得.七味葡萄散由阜新蒙藥有限責任公司提供.

1.2 動物：Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～220g，甘肅中醫藥大學實驗中心購買，SPF級環境飼養，室溫20～26℃，實驗動物倫理委員會批準編號1509005，動物飼料也由上述單位提供.

1.3 試劑：氫氧化鋁（天津市光復精細化工研究所）、卵清蛋白OVA（sigmaA5503卵白蛋白）、水合氯醛（鄭州優然食品化工有限公司）、多聚甲酵溶液（丹東市龍海試劑廠）.

2 方法

2.1 分組及疾病模型建立：30 只大鼠隨機分為空白對照組、哮喘模型組、七味葡萄散干預組［0.15g/（kg·d）］，每組10 只.哮喘模型組、七味葡萄散干預組用10%卵清蛋白（OVA）1.0ml 致敏液（致敏液由100mgOVA、100mg氫氧化鋁和800mg生理鹽水配置成1ml混懸液）進行腹腔注射，共注射3次（第1日，第7日，第14日），第15日開始，在口鼻全相態毒性實驗設備中以10%卵清蛋白霧化激發，連續激發兩周（每日一次，一次20min）.空白對照組腹腔注射1.0ml生理鹽水和生理鹽水霧化，次數及方法同其他2組.七味葡萄散干預組在每次霧化激發前30min，給予七味葡萄散（［0.15g/（kg·d）］）灌胃（藥物按人與動物體表面積比率換算：大鼠用量=人口服總量×大鼠與人體表比）.空白對照組和哮喘模型組每次霧化激發前給與相同劑量的生理鹽水灌胃.

2.2 行為學評價：根據文獻［3］介紹的方法，對末次激發引喘后大鼠進行行為學及呼吸系統癥狀程度的評分，用以評價大鼠癥狀表現程度，具體評分標準：0分：呼吸正常或僅有呼吸急促；1分：顫動或點頭；2分：咳嗽或呼吸加深；3分：節律性收腹樣喘促；6分：跌倒.

2.3 取材及標本制備：標本制備與處理：連續14天霧化激發后，在第15天用水合氯醛在大鼠腹部進行注射麻醉，麻醉后取右肺上葉肺組織，并置于甲醛溶液進行固定.將固定好的肺組織采用常規石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察.

2.4 肺組織損傷病理學評分：根據文獻［3］介紹的方法，采用雙盲病理評分法，對大鼠肺組織HE染色病理切片進行肺組織損傷病理學評分，即由兩位病理專科醫生根據炎性細胞浸潤、支氣管上皮細胞脫落、肺泡間隔增厚等三項指標進行分級評分，計算總分，并根據兩位病理科醫生評分結果最后計算平均分，用以半定量評估肺組織損傷程度.支氣管上皮細胞脫落評分標準：0分：正常（無或偶見黏膜上皮鱗狀上皮化生）；1分：輕度脫落（黏膜上皮鱗狀上皮化生，偶見上皮細胞脫落）；2分：中度脫落（黏膜上皮鱗狀上皮化生，上皮細胞部分脫落，露出固有膜）；3分：重度脫落（黏膜上皮鱗狀上皮化生，上皮細胞成片脫落，固有膜破壞）.肺泡間隔增厚評分標準：0分：正常（無肺泡間隔增厚）；1分：輕度增厚（肺泡間隔增厚至正常厚度的1～2倍）；2分：中度增厚（肺泡間隔增厚至正常厚度的3～5倍）；3分：重度增厚（肺泡間隔增厚至正常厚度的5倍以上）.炎性細胞浸潤評分標準：0分：正常（無或偶見炎性細胞浸潤）；1分：輕度細胞浸潤（散在炎性細胞浸潤，或偶可見部分聚集成團）；2分：中度細胞浸潤（炎性細胞聚集成團，但尚未侵及支氣管黏膜下層）；3分：重度細胞浸潤（大量炎性細胞成團浸潤，侵及支氣管黏膜下層甚至黏膜層）.

3 統計學分析

4 結果

4.1 大鼠行為學表現及評價

在霧化激發階段，空白對照組大鼠呼吸頻率均勻、毛發光滑、進食正常.哮喘模型組大鼠均不同程度的出現呼吸急促、撓臉、煩躁不安、點頭、顫動、咳嗽、節律性收腹樣喘促、跌倒、反應遲鈍、進食減少、大便稀溏、皮毛黃濕脫落無光澤等.七味葡萄散干預組上述癥狀表現比較輕.對末次激發引喘后各組大鼠進行行為學癥狀程度評價（如表1），與空白對照組相比，哮喘模型組和七味葡萄散干預組大鼠行為學癥狀程度評分均明顯升高，均具有統計學差異（P<0.01）.七味葡萄散干預組與哮喘模型組相比，大鼠行為學癥狀程度評分均減少，且具有統計學差異（P<0.05）.整體來看，各組大鼠行為學評分由大到小依次為：哮喘模型組>七味葡萄散干預組>空白對照組，呈逐漸遞增趨勢.

表1 末次激發引喘后各組大鼠行為學癥狀程度評分表（分，±s）（n=10）

表1 末次激發引喘后各組大鼠行為學癥狀程度評分表（分，±s）（n=10）

注：與空白對照組相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與哮喘模型組相比＃P<0.05.

組別空白對照組哮喘模型組七味葡萄散干預組行為學癥狀程度評分0.300±0.152 3.600±1.776＊＊1.600±0.699＊＊＃

4.2 肺組織病理切片HE染色觀察

空白對照組：支氣管和肺組織結構清晰，肺泡結構完整，肺泡腔、肺間質均未見炎癥細胞浸潤（如圖①）.極個別空白對照組肺組織HE染色切片可見肺內可見細支氣管上皮有少量脫落，圍繞細支氣管周圍的結締組織可見淋巴細胞和少許粒細胞浸潤，肺泡間隔稍有增厚，但均屬輕度.

哮喘模型組：肺組織可見明顯的病理損傷.肺泡和支氣管結構不完整，支氣管壁纖維組織和平滑肌細胞增生增厚，管壁水腫、粘膜上皮部分脫落，肺泡腔內和支氣管壁可見大量炎性細胞浸潤，炎性細胞主要是巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡間隔明顯增厚（如圖②）.

七味葡萄散干預組：與模型組比較肺組織損傷較輕.在支氣管和血管周圍可見少量的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞；肺泡結構基本完整，肺泡上皮細胞及肺間隔損傷較輕，毛細血管輕度充血，部分肺泡腔內可見少量的炎性細胞和紅細胞滲出；支氣管結構基本完整，管壁結構清晰未見明顯的纖維組織的增生和平滑肌細胞增生，氣道上皮細胞排列整齊、上皮細胞幾乎未見明顯的損傷（如圖③）.

顯微鏡下各組大鼠肺組織病理形態學改變（HE染色，×200）圖①為空白對照組；圖②為哮喘模型組；圖③為七味葡萄散干預組

4.3 肺組織HE染色半定量分析

依據大鼠肺組織損傷病理學評分標準，對炎癥細胞浸潤、支氣管上皮細胞脫落、肺泡間隔增厚等方面進行評分統計，并進行兩兩比較（如表2）.與空白對照組相比，哮喘模型組和七味葡萄散干預組大鼠肺組織損傷病理學評分均增加，具有統計學差異（P<0.05或P<0.01）.七味葡萄散干預組與哮喘模型組相比，大鼠肺組織損傷病理學評分減少，且具有統計學差異（P<0.05或P<0.01）.整體來看，各組大鼠肺組織損傷病理學評分從高到低依次為：哮喘模型組>七味葡萄散干預組>空白對照組，呈逐漸遞減趨勢.

表2 各組大鼠肺組織損傷病理學評分表（分，±s）（n=10）

表2 各組大鼠肺組織損傷病理學評分表（分，±s）（n=10）

注：與空白對照組相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與哮喘模型組相比＃P<0.05，＃＃P<0.01.

組別空白對照組哮喘模型組七味葡萄散干預組總分1.300±1.828 6.500±1.433＊＊3.900±1.197＊＊＃＃炎細胞浸潤0.600±0.843 2.400±0.516＊＊1.400±0.516＊＃＃支氣管上皮脫落0.400±0.699 2.400±0.516＊＊1.300±0.483＊＊＃＃肺泡間隔增厚0.300±0.483 1.700±0.674＊＊1.200±0.421＊＊＃

5 討論

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現為氣道炎癥、氣流受限和氣道高反應性［4］.在臨床上最常見的三個癥狀為咳嗽、胸悶和氣促［5］.目前對哮喘暫無有效的根治方法，其治療仍是以控制癥狀為主，治療藥物有吸入性糖皮質激素、β2受體激動劑、抗膽堿能藥物及白三烯調節劑等，其中吸入性糖皮質激素是治療哮喘最有效的藥物，但部分哮喘患者常規吸入糖皮質激素治療無效［6］，且高劑量吸入激素可增加條件致病菌感染的患病率［7］.

中藥在治療哮喘上有著悠久的歷史和獨到的療效，中藥能控制氣道炎癥，延緩氣道重建，調節免疫和神經內分泌，具有多環節、多靶點、多途徑等特點［8，9］.臨床研究發現［10，11］七味葡萄散在治療慢性阻塞性肺疾病方面有較好的療效.七味葡萄散系蒙古族驗方，源于《醫法海鑒》，被收入在《中華人民共和國藥典》2020年版一部，由白葡萄干、紅花、甘草、肉桂等配合組成，具有清肺、止咳、定喘等功能［2］.方中以性涼，味甘，清肺熱、止咳平喘良藥白葡萄干為主；配合以涼血益肝良藥紅花，止咳益肺良藥石膏、甘草、香附，加配以石榴、肉桂等.從現代醫學角度，七味葡萄散平喘作用機制未見報道.本實驗利用卵清蛋白致敏和激發大鼠，建立哮喘大鼠模型并使用七味葡萄散進行干預，觀察七味葡萄散的平喘作用及其機制.

咳嗽、胸悶和氣促是哮喘的主要癥狀，是氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑等病理改變反應于外的表現.減輕疾病外部表現是改善病理改變的必要依據，是哮喘疾病診斷和防治療效評價的主要內容［3］.本實驗對末次激發引喘后大鼠進行行為學評價，結果顯示，哮喘模型組和七味葡萄散干預組較空白對照組行為學程度評分均升高，且具有統計學差異，說明本實驗成功建立了哮喘動物模型.七味葡萄散干預組與哮喘模型組相比，大鼠行為學癥狀程度評分減少，且具有統計學差異，說明七味葡萄散可減輕哮喘哮喘模型大鼠的哮喘癥狀.

氣道炎癥是哮喘發病的基礎［8］，浸潤的炎性細胞以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等為主［12］.本實驗肺組織病理學顯示，哮喘模型組大鼠肺組織肺泡壁結構受損，肺泡壁增厚，支氣管腔狹窄，黏膜上皮細胞脫落，支氣管與血管周圍重度炎性細胞浸潤，炎性細胞主要是巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞；七味葡萄散干預后，能改善哮喘大鼠炎癥細胞浸潤、支氣管上皮細胞脫落、肺泡間隔增厚等肺組織病理損傷.大鼠肺組織損傷半定量評價結果顯示，與空白對照組相比，哮喘模型組和七味葡萄散干預組大鼠肺組織損傷病理學評分均增加，具有統計學差異.七味葡萄散干預組與哮喘模型組相比，大鼠肺組織損傷病理學評分減少，具有統計學差異.說明七味葡萄散對哮喘模型大鼠具有一定的防治作用.

綜上所述，七味葡萄散作為一種中藥制劑，在卵清蛋白誘發的哮喘模型大鼠中，具有改善哮喘模型大鼠的癥狀和減輕哮喘模型大鼠氣道病理損傷的作用，但具體的細胞學、分子學作用機制仍有待進一步研究.