microRNA-125b通過調(diào)控Nrf2/Keap1信號(hào)通路影響光感受器細(xì)胞氧化應(yīng)激

劉金霞，王鈺池，郭卓，趙江月，孔珺，秦宇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005）

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是老年人群不可逆轉(zhuǎn)性盲的主要原因之一［1］。AMD分為干性和濕性2種類型，其中，干性AMD占比較多，目前尚無有效治療手段［2-3］。干性AMD的病理改變以光感受器細(xì)胞變性為主［4］。視網(wǎng)膜氧化損傷已被確定為干性AMD的主要致病因素之一，光感受器細(xì)胞受到各種來源的氧化應(yīng)激刺激，導(dǎo)致視網(wǎng)膜退行性變，嚴(yán)重影響視力［5］。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體發(fā)揮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。基礎(chǔ)狀態(tài)下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，引起Nrf2降解；氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1解離，移位入核，與下游基因血紅素單加氧酶（heme oxygenase-1，HO-1）結(jié)合，發(fā)揮抗氧化作用［6-7］。因此，通過激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路，可增加細(xì)胞抗氧化反應(yīng)能力，減輕細(xì)胞氧化損傷［8］。微RNA（microRNA，miRNA）可通過內(nèi)源性RNA干擾機(jī)制抑制多種靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能［9］。已有研究［10］證明，多種miRNAs可通過調(diào)控Nrf2影響AMD發(fā) 病，包 括miR-144［11］、miR-141［12］、miR-626［13］等。但光感受器細(xì)胞中miRNAs對(duì)Nrf2的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究在干性AMD中miR-125b通過Nrf2/Keap1信號(hào)通路對(duì)光感受器細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠視錐細(xì)胞系661W細(xì)胞由美國(guó)休斯頓大學(xué)Muayyad R.AL-UBAIDI教授贈(zèng)予。DMEM培養(yǎng)液、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、PBS（中國(guó)江蘇凱基生物公司），3%過氧化氫（H2O2）溶液、DMSO（美國(guó)SIGMA公司），胎牛血清（澳大利亞AusGeneX公司），RNAiso Plus、LipofectamineTMRNAiMAX、OPTI-MEM（美國(guó)Invitrogen公司），PrimerScript RT reagent Kit（日本TaKaRa公司）、TB Green premix Ex Taq Ⅱ（日本TaKaRa公司），增強(qiáng)型CCK-8試劑盒（美國(guó)Apexbio公司），mRNA引物（中國(guó)上海生工生物工程公司），miR-125b與RNU6B的RT引物、PCR引物、miR-125b模擬物、模擬物對(duì)照、抑制物、抑制物對(duì)照（中國(guó)廣州銳博公司），SDS-PAGE膠（中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司），PCR逆轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。RT-PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystem公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含5%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的 DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 661W細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期661W細(xì)胞消化并離心后，用含5%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以每孔2×104細(xì)胞接種于96孔板中。用正常培養(yǎng)細(xì)胞組作為對(duì)照組，用培養(yǎng)基不含細(xì)胞組作為空白對(duì)照組。用不同濃度H2O2（400，600，800，1 000 μmol/L）處理細(xì)胞6 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（A）。細(xì)胞增殖活性=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將661W細(xì)胞培養(yǎng)至30%～50%融合。用LipofectamineTMRNAiMAX和無血清Opti-MEM培養(yǎng)基將miR-125b模擬物、模擬物對(duì)照（100 nmol/L）和miR-125b 抑制物、抑制物對(duì)照（30 nmol/L）分別轉(zhuǎn)染至661W細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)：用TRIzol提取各組細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR試劑盒TB Green premix Ex Taq Ⅱ檢測(cè)miR-125b與Keap1/Nrf2/HO-1mRNA的表達(dá)水平，RNU6B為miR-125b內(nèi)參對(duì)照，GAPDH為Keap1/Nrf2/HO-1內(nèi)參對(duì)照。所有操作均嚴(yán)格遵循說明書。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物序列（5’-3’）Tab.1 Primers for qPCR assay（5’-3’）

1.2.5 Western blotting檢測(cè)：利用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。95 ℃水浴10 min變性，蛋白上樣行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。用Keap1抗體（1 ∶5 000）4 ℃過夜孵育，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。將孵育過一抗的PVDF膜用TBST洗3次，10 min/次，用山羊抗兔二抗（1 ∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，10 min/次。ECL 發(fā)光顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Graph-Pad Prism 8作統(tǒng)計(jì)圖。所有結(jié)果均以表示；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中miR-125b與Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA的表達(dá)

分別利用400、600、800、1 000 μmol/L H2O2處理661W細(xì)胞6 h，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性變化。結(jié)果顯示，當(dāng)H2O2濃度為800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性降低至50%左右，故后續(xù)試驗(yàn)選用800 μmol/L H2O2構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著H2O2濃度逐漸增加，miR-125b表達(dá)逐漸降低。661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，Nrf2及其下游基因HO-1mRNA表達(dá)升高，Keap1mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖1。說明661W細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激后，miR-125b表達(dá)降低，Nrf2及其下游基因HO-1表達(dá)水平升高，Keap1表達(dá)水平降低。

圖1 661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中miR-125b及Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-125b and Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA in oxidative stress model of 661W cells

2.2 miR-125b調(diào)控661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA的表達(dá)

661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，轉(zhuǎn)染miR-125b 模擬物組miR-125b、Nrf2和HO-1mRNA的表達(dá)顯著高于轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物組miR-125b、Nrf2和HO-1mRNA的表達(dá)水平顯著低于轉(zhuǎn)染抑制物對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染miR-125b 模擬物組和轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物組分別與轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)照組和轉(zhuǎn)染抑制物對(duì)照組比較，Keap1表達(dá)在mRNA水平無明顯變化，見圖2。說明miR-125b可能通過調(diào)控Nrf2及HO-1mRNA的表達(dá)以增強(qiáng)661W細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，但對(duì)Keap1mRNA的表達(dá)無明顯影響。

圖2 調(diào)控miR-125b對(duì)661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Up-or down-regulating miR-125b affects expression of Keap1/Nrf2/HO-1 mRNA

2.3 miR-125b通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Keap1蛋白表達(dá)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路

如前所述，661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，miR-125b 對(duì)Keap1mRNA的表達(dá)無明顯影響，Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b 模擬物組Keap1的蛋白表達(dá)水平顯著低于轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)照組；轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物組Keap1的蛋白表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染抑制物對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖3。說明miR-125b可能通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Keap1蛋白的表達(dá)，調(diào)控Nrf2及HO-1的表達(dá)，從而促進(jìn)661W細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。

圖3 調(diào)控miR-125b對(duì)Keap1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Up-or down-regulating miR-125b affects expression of Keap1 protein

3 討論

干性AMD早期病變主要表現(xiàn)為玻璃膜疣形成，玻璃膜疣數(shù)目和大小的增加顯著增加疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)；干性AMD的晚期病變地圖狀萎縮的形成主要由光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞死亡引起［14］。視網(wǎng)膜由RPE和神經(jīng)視網(wǎng)膜組成，其生理結(jié)構(gòu)和高代謝活性對(duì)視覺功能至關(guān)重要，尤其容易受到氧化損傷。視網(wǎng)膜氧化損傷是包括AMD在內(nèi)的視網(wǎng)膜退行性疾病的主要致病因素之一［15］。

Nrf2信號(hào)通路是體內(nèi)主要的抗氧化信號(hào)通路之一，關(guān)于miRNAs對(duì)該通路的調(diào)控目前國(guó)內(nèi)外尚未見明確報(bào)道。LAI等［16］發(fā)現(xiàn)，蝦青素能夠通過PI3K/Akt/Nrf2通路減少661W細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，并抑制細(xì)胞凋亡。CARLOTTA等［17］發(fā)現(xiàn)2-乙酰基-5-四羥基丁基咪唑能夠通過激活Nrf2/HO-1通路減輕H2O2誘導(dǎo)的661W細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。此外，Nrf2激動(dòng)劑RS9能夠減輕光誘導(dǎo)的661W細(xì)胞損傷［18］。miR-125b與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和分化等密切相關(guān)［19］。YANG等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-125b通過Keap1/Nrf2通路減輕肝損傷，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證了miR-125b與Keap1之間存在直接的連接位點(diǎn)，提示了miR-125b對(duì)Keap1/Nrf2直接的調(diào)控作用。

本研究利用H2O2構(gòu)建光感受器細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，研究在干性AMD發(fā)病過程中miR-125b對(duì)抗氧化信號(hào)通路Keap1/Nrf2/HO-1可能的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-125b在光感受器細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中表達(dá)顯著降低，Nrf2及其下游基因HO-1表達(dá)增加，Keap1表達(dá)降低，表明當(dāng)光感受器細(xì)胞受到氧化刺激以后，Keap1表達(dá)減少，對(duì)Nrf2的錨定作用降低，因此Nrf2表達(dá)增加且移位入核發(fā)揮抗氧化作用。轉(zhuǎn)染miR-125b 模擬物后，Nrf2/HO-1表達(dá)增加，Keap1表達(dá)在mRNA水平無明顯變化，在蛋白水平顯著降低，提示miR-125b可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Keap1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2/HO-1的表達(dá)，從而增強(qiáng)光感受器細(xì)胞的抗氧化能力，轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。然而，miR-125b與Keap1之間的直接靶向關(guān)系還需將來進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，miR-125b可促進(jìn)光感受器細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，該作用可能通過調(diào)控Keap1/Nrf2/HO-1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。本研究利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法調(diào)控miR-125b在光感受器細(xì)胞中的表達(dá)，初步論證了miR-125b在干性AMD發(fā)病過程中的調(diào)控作用，提示miR-125b可能成為干性AMD治療的新靶點(diǎn)。