實時熒光定量PCR技術在生物飼料中的應用

康凌宇， 倪 忠， 武俊明， 陳華友*

（1.江蘇大學生命科學學院，江蘇鎮江 212000；2.江蘇中興藥業有限公司，江蘇鎮江 212000）

隨著我國畜牧飼料行業的發展，生物飼料成為研究熱點之一。生物飼料是通過基因工程、蛋白質工程、發酵工程等現代生物技術開發的新型飼料產品 （蔡輝益等，2014），在提高動物的生產性能、飼料的適口性和消化率，降低抗生素使用，降低發病率和提高成活率方面展現出巨大的潛力。發酵菌種是生物飼料的重要組成部分，特色功能菌株的篩選、菌株的組合效果是生物飼料產業化的研究方向。近年來，實時熒光定量PCR技術因其獨特的優點，被廣泛應用于基礎科學研究、轉基因產品和食品安全檢測、醫學診斷等研究實踐領域，但在生物飼料的檢測中應用較少，與傳統的基于微生物培養的檢測方法相比，實時熒光定量PCR技術更加省時省力。因此，本文對實時熒光定量PCR的原理、技術分類和在生物飼料中的應用進展進行綜述，并總結了實時熒光定量PCR在生物飼料實驗中的注意事項。

1 實時熒光定量PCR的原理

實時熒光定量PCR（qPCR）是以常規PCR為基礎的一種新型核酸定量技術。其原理是在反應體系中加入熒光化學物質，隨著PCR反應過程中擴增產物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加，通過熒光信號變化實時監測整個PCR反應進程，將結果繪制成熒光擴增曲線圖，從而定量定性分析起始模板。PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，在熒光信號指數擴增階段，熒光信號達到閾值，且熒光信號遠高于背景信號，這種情況下產生的循環數稱為Ct值，通過Ct值對起始模板進行定量分析（Kozera等，2013）。在此反應階段，反應組分不受限制，Ct值重復性高，是比在終端測定累計PCR產物量更為可靠的測量起始拷貝數的方法（Giulietti等，2001）。

2 實時熒光定量PCR技術檢測方法和定量方法分類

2.1 檢測方法 根據實時熒光定量PCR所用的熒光模式不同，其方法可分為DNA染料法和熒光探針法。SYBR GreenⅠ是應用最廣泛的一種熒光染料，僅能與DNA雙鏈結合，只有結合到DNA雙鏈上的SYBR染料才能夠發射熒光信號，沒有結合的不發射熒光，從而保證了熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。由于SYBR GreenⅠ可以和任何dsDNA的小溝結合，因此需要通過熔融曲線分析來檢查擴增片段的特異性 （Lin等，2014）。EvaGreen是替代 SYBR Green的第三代dsDNA結合染料，相比于非飽和的SYBR Green染料，EvaGreen染料穩定性和靈敏度更強，對PCR反應的抑制性更小，在飽和情況下產生的熒光信號更強（Mao 等，2007）。

TaqMan探針是使用最廣泛的熒光探針，當探針完整時，熒光報告基團發射的熒光被淬滅基團吸收；在PCR延伸階段，Taq酶的5"端外切酶活性把探針降解，使得報告基團與淬滅基團分離，報告基團發出熒光信號；其可以利用多種熒光報告基團同時進行多重實時熒光定量PCR分析，特異性較強（Swayne 等，2011）。

2.2 定量方法

2.2.1 絕對定量 絕對定量是使用已知的標準曲線對未知樣品進行定量分析的一種方法。絕對定量的標準品一般是指含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質粒、cDNA以及PCR產物等，將標準品倍比稀釋并檢測每個稀釋度的Ct值，以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，測得的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線（Dhanasekaran等，2010），通過標準曲線推算未知樣品的初始量。

2.2.2 相對定量 相對定量是在一定樣本中，靶序列相對于另一參照樣本的量的變化，也就是比較經過處理的樣本和未經處理的樣本之間的相對基因表達差異。相對定量又包括比較標準曲線的相對定量和比較Ct值的相對定量。前者能準確地量化初始材料的載量，檢測的結果是目的基因與參照基因的比值，只要參照基因恒定，比值的變化也就反映了目的基因的變化（Livak等，2001）。后者是同時擴增待測靶基因片段和一個內源性管家基因片段，通過數學公式計算相對量；這種方法的前提是靶基因和內源控制物的擴增效率基本一致，所以在應用過程中效率的偏移會對實際拷貝數估計產生一定影響（Wang等，2019）。

3 實時熒光定量PCR技術在生物飼料中的應用

3.1 有害菌檢測 飼料在生產、儲藏、運輸、銷售等一系列過程中存在受到微生物污染的可能性，檢測飼料中的致病菌至關重要。由沙門菌引起的食源性疾病居我國細菌性食源性疾病的首位，其既能引起多種動物感染，也常引起人類食物中毒等群體暴發性事件。阮靖華等 （2018）以沙門菌invA基因作為構建質粒的靶基因進行絕對定量，該法對基因組DNA的檢測靈敏度達17 copies/μL，飼料樣品的檢出率與國標法一致。楊美榮等（2015）也驗證了以DNA為基礎的沙門菌檢測方法的特異性，熒光定量PCR對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢測結果均為陰性，可用于飼料中沙門菌的檢測。Yu等（2009）通過qPCR檢測生物飼料發酵過程中多種致病菌的變化，結果發現添加益生菌發酵的固態飼料可以降低金黃色葡萄球菌、產毒大腸桿菌等致病菌的水平，且在整個發酵過程中都沒有檢測到沙門菌。此外，霉菌污染也是影響生物飼料適口性的重要因素，有研究表明，乳酸菌對產毒素霉菌的生長有抑制作用 （Dogi等，2015）。Nateghi等（2016）利用相對定量分析參與黃曲霉毒素生物合成調控的aflR基因，發現嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌對aflR基因的表達有抑制作用，證明了乳酸菌可以抑制寄生曲霉的生長并降低黃曲霉素的產量。已有研究應用qPCR對黃曲霉毒素水平與其決定基因表達量的相關性進行檢測（Iheanacho等，2014），以期從基因水平預測飼料中黃曲霉毒素產量的潛在風險。微生物檢測的傳統方法需要選擇性培養基、生物學特性及生化測定，其過程費力耗時，實時熒光定量PCR技術重復性好、定量準確，為快速鑒別診斷飼料中致病菌提供了有效的方法。

3.2 發酵飼料益生菌定量 由于發酵飼料成分比較復雜，在我國尚沒有一個完善的發酵飼料品質評定體系。當前人們普遍認為益生菌活菌含量是評定發酵飼料品質的一項重要指標。傳統檢測發酵飼料益生菌含量的標準方法是平板計數法。由于部分乳酸菌也可以在有氧情況下生長，因此在涉及乳酸菌的發酵過程中，平板法會大大高估總需氧菌的數量，基于平板計數的微生物定量所提供的飼料質量信息是有限的 （Passoth等，2010），這些限制可以通過使用基于核酸序列比較與培養無關的分子技術來克服。Fibi等（2016）將qPCR分析方法用于鑒定肉雞飼料中動物雙歧桿菌，并通過抑制消減雜交技術獲得其特異性序列，設計引物并構建相關標準曲線，其最低檢測濃度為 2×101cfu/g。李婷婷（2019）通過 SYBR Green 染料動態檢測了秸稈飼料發酵過程中發酵微生物的變化，該方法方便了雙歧桿菌等厭氧細菌的檢測。魏愛彬（2012）通過qPCR技術研究單一菌種及復合菌種發酵全價飼料過程中的菌群變化，結果發現，不同試驗組菌群變化趨勢存在差異，干酪乳桿菌、植物乳桿菌單一菌種發酵組在發酵3 d時達到最大值，后續發酵過程中菌量變化不明顯，發酵10 d時活菌數均達到8.00 lg cfu/g以上；而復合菌種發酵組中干酪乳桿菌在發酵4 d達到峰值后持續下降，發酵10 d時為6.58 lg cfu/g，植物乳桿菌發酵2 d時活菌數最高，達9.31 lg cfu/g，之后無顯著變化。種間競爭可能是導致飼料中微生物多樣性下降的一個因素，能夠適應發酵環境的微生物得以生存并形成優勢（Yang等，2016）。同時在利用Ct值檢測飼料中微生物時，應考慮處于VBNC狀態下的細胞和死菌DNA對檢測結果的影響。胡會龍等（2019）用EMA來消除死菌DNA擴增對結果造成的誤差，將優化后的EMA處理條件用于發酵飼料中乳酸菌的檢測，以乳酸菌16S rRNA為目標基因構建標準曲線，檢測結果與平板計數具有較高的符合度。qPCR可以同時對多個樣品進行檢測，縮短了檢測時間，在生產中應用可以極大地減少工作量，提高檢測效率。目前只有少數研究報道利用qPCR技術監測發酵飼料發酵過程中微生物群的動態變化，因此，需要進一步研究qPCR技術定量檢測發酵飼料接種益生菌的穩定性，結合pH與乳酸含量變化，為益生菌在生物飼料中的應用提供數據支持。

3.3 飼喂效果檢測 隨著生物飼料研究的逐漸深入，生物飼料對提高飼料利用率、改善畜禽腸道健康、提高畜產品品質等方面的作用需要進一步明確（蔡輝益，2019）。研究發現，酵母發酵飼料具有提高飼料消化率、動物生長性能和增強機體免疫功能等生物學作用（Carlson等，2003）；張棋煒等（2017）通過qPCR技術發現酵母發酵飼料能夠顯著提高瘤胃細菌總數并促進除牛鏈球菌以外的5種瘤胃功能細菌的生長繁殖。王夢芝等（2010）用熒光定量PCR技術研究了不同蛋白質飼料對嗜淀粉瘤胃桿菌生長的影響，結果表明豆粕蛋白飼料更利于嗜淀粉瘤胃桿菌的生長，其密度及數量在細菌總數中的比例最高。幼畜體內細菌生態系統的建立可能會影響其成年后腸道細菌的組成，從而影響消化效率，且幼畜初期的腸道微生物環境受母體消化菌群支配，優化母體的腸道菌群是增加幼畜腸道有益微生物的數量及活性的一種策略，Faubladier等（2013）利用qPCR檢測小馬駒體內纖維素降解菌的菌量變化，研究了產仔前后母馬補充發酵飼料產品的影響。孫艷等（2017）利用相對定量檢測白斑綜合癥病毒 （WSSV）刺激后，蝦血淋巴中酚氧化酶原（proPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）的基因表達量，發現飼料中添加堅強芽孢桿菌活菌與溶藻弧菌可提高凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力。因此，利用實時熒光定量PCR技術檢測宿主腸道微生物和相關免疫基因表達量，可以有效檢測生物飼料的飼喂效用。傳統的基于培養的細菌學檢測方法昂貴又冗長，好多菌體外也不容易同步培養，且會低估腸道菌群的多樣性，以DNA為基礎的實時熒光定量PCR技術為腸道微生物的研究提供了便利。

3.4 轉基因成分檢測 識別飼料基質中的作物是針對轉基因生物篩選的重要一步，大豆、玉米、油菜、大米、棉花、甜菜、土豆等是重要的轉基因材料來源。已有研究（Campos等，2018；Mbongolo等，2011）通過SYBR Green染料和TaqMan探針對動物飼料中的植物物種進行特異性檢測，將此法與針對轉基因元素的qPCR方法相結合，可以有效確定飼料中的轉基因成分。花椰菜花葉病毒35S啟動子（p35S）和胭脂堿合成酶終止子（tNOS）是迄今為止在商業轉基因作物中最具代表性的通用重組元件。Barbau等（2010）采用SYBR Green熒光定量PCR技術檢測p35S和tNOS核心元件，這種方法特異性好、靈敏度高，并適用于檢測含有p35S或tNOS元素的低含量轉基因材料。有些生物飼料中使用的轉基因微生物攜帶抗生素耐藥性（AMR）基因，由于基因水平轉移機制可能導致病原體和腸道菌群通過攝入含有AMR基因的轉基因微生物或相關重組DNA而獲得AMR基因，因此通過qPCR檢測AMR基因的存在，以防止生物飼料中此類轉基因微生物DNA的意外污染（Fraiture等，2020）。生物飼料中轉基因成分的使用一直是公眾關注的焦點，qPCR技術可以對生物飼料中的轉基因成分進行鑒定，并評估其對公眾健康和環境的潛在風險。

4 實時熒光定量PCR在生物飼料中應用的注意事項

4.1 DNA提取 有效提取高質量DNA的方法是應用qPCR技術研究生物飼料的前提。DNA提取方法的選擇對qPCR檢測微生物數量有顯著影響，DNA提取效率在細菌、真菌和原生動物群落之間存在差異，會導致這些種群被高估或低估，使用不同DNA提取方法獲得的qPCR結果不一定具有可比性（Henderson等，2013）。由于生物飼料組分復雜，傳統的提取純培養微生物DNA的方法并不能完全適用，并且可能遺漏劣勢微生物群體；發酵產物中所含的蛋白質和脂肪，會對其DNA提取效率產生一定影響，進而影響實驗結果，如雙歧桿菌、乳酸菌等革蘭氏陽性菌的細胞壁結構通常需要特殊處理才能分解；在檢測含有芽孢桿菌的樣品時，由于從芽孢中直接提取DNA較為困難，可能需要額外的萌發步驟，因此選擇合適的提取方法尤為重要。沈麗等（2012）采用磁珠法，加入裂解緩沖液和蛋白酶K，提取植物源性飼料中的核酸，并通過qPCR鑒定動物源性成分，結果發現磁珠核酸提取法的實驗效果優于商品化核酸提取試劑盒。蛋白酶K處理法對酶的質量有很大的依賴性，應該避免蛋白酶K的長期儲存對細胞裂解造成的影響。馬俊孝等（2009）通過間接法提取青貯飼料中微生物總DNA，將樣品用PBS緩沖液洗滌后收集菌體沉淀，通過溶菌酶、CTAB等試劑裂解細胞，并用異丙醇沉淀DNA，提取的DNA可直接用于下游分子實驗。溶菌酶可以高效分解革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖，與EDTA聯合使用時，對細菌細胞的破壞作用尤為顯著（Abdulamir等，2010）。溶菌酶、RNase以及商業試劑盒中額外的蛋白質沉淀步驟，可以有效去除生物飼料中的PCR抑制物，提高DNA純度，避免qPCR擴增反應失敗和假陰性結果。直接對生物飼料中微生物總DNA進行分析，避免了預增菌、純化培養等步驟，在一定程度上克服了傳統培養法的弊端，且可以用來探究樣品中微生物的多樣性和動態變化情況。

4.2 靶序列選擇 菌種對于生物飼料來說至關重要，是生物飼料的核心。生產過程中，常出現菌株來源不明、不純和菌種退化等現象，因此我們首先要保證菌種的安全性，確保菌種及其產物對動物、人體及環境無害。實時熒光定量PCR技術通過測定目標基因數量來定量微生物種群，因此靶序列的選擇尤為重要。以乳桿菌屬為例，16S rRNA序列同源性分析已作為細菌分類鑒定的有力佐證，但是乳桿菌屬分類復雜，16S rRNA基因序列同源性高，無法建立特異性高的引物和探針；如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌親緣關系較近，以groL、tuf和16S rRNA為目標基因設計的特異性引物會進行交叉擴增（Achilleos等，2013）。此外，由于16S rRNA基因可以在多個拷貝中存在，且在不同物種中16S rRNA基因拷貝存在差異，因此qPCR法計數的細菌群體中16S rRNA的拷貝數大多高于常規培養定量的數量（cfu）（Chaloemnon 等，2016）， 這導致樣本中目標菌數量被高估，定量結果存在一定誤差。研究表明 ，gyrB、recA、rpoD、hsp60 等 基 因 序 列 較 16S rRNA序列，可以更好地區分相似種，因此更適合用作引物設計的靶基因（楊小紅等，2014）。陳臣等（2013）利用SMM系統篩選植物乳桿菌特異性序列，選擇CAAX家族蛋白酶基因設計特異性引物進行qPCR檢測，該引物對其他近源菌株均無相應擴增。同時有研究應用抑制消減雜交（SSH）鑒定基因組DNA片段，進行特異性引物的開發（Sattler等，2014）。除此之外，有些生物飼料涉及高溫處理會導致DNA片段化，當擴增200 bp以上的目標序列時，很難獲得可靠的結果，因此在DNA嚴重降解的飼料樣品中，物種鑒定必須依賴于短DNA靶基因的擴增。隨著許多物種全基因組測序的完成，可以通過生物信息學技術建立新的方法，從全基因組水平比較篩選出種內保守的物種特異性DNA序列作為靶基因，提高實驗的準確性。

4.3 死菌和活菌的區分 生物飼料中活的益生菌才能在動物胃腸道中發揮其益生作用，由于實時熒光定量PCR不能區別活菌與死菌，因此有效的前處理步驟至關重要。EMA是一種核酸交聯試劑，能夠選擇性地穿過細胞壁和細胞膜，在強光照射下與基因組DNA共價交聯，使DNA形成沉淀，從而降低了DNA模板的可擴增性。盡管EMA可以有效減少來自死細胞的PCR信號，但它可以部分進入細胞膜完整的活細胞，誘導其基因組DNA的降解（Nam等，2011）。研究表明，可以用PMA替代EMA處理活細胞，PMA比EMA的電荷更多，使得PMA更難穿透完整的細胞膜，對活細胞的選擇性更高且細胞毒性低，可以彌補EMA的不足，得到較好的檢測效果（Yán～ez等，2011）。 將EMA或PMA與qPCR技術相結合，排除樣本中死菌信號對實驗結果的干擾，一定程度上克服了qPCR的不足之處，有利于生物飼料發酵微生物菌群變化的研究。

4.4 其他 實時熒光定量PCR在生物飼料的應用中，面臨的一個常見問題是存在不可預測的擴增產物，如引物二聚體，在特異性靶基因較少的樣品中最為明顯，好的引物可以擴增單一的產物，其區別在于產生單一的熔解曲線峰，而不是產生非特異性產物，這對實時熒光定量PCR檢測結果的準確性具有重要意義（Martín 等，2008）。 實時熒光定量PCR技術除了受樣品DNA產量的影響外，還與樣本中存在的細胞總數有關，例如在檢測生物飼料中的動物蛋白源時，其結果可能根據組織類型的不同而變化。生物飼料是不同物種材料組成的混合物，檢測時必須考慮交叉反應性以及所分析的樣本類型，不同的樣本類型具有不同的化學和結構組成，可以通過不同的機制抑制PCR反應，因此標準曲線在應用于不同的基質時是不準確的（Cocolin等，2011）。此外，發酵飼料中的微生物可能分布不均勻，如沙門氏菌被認為是傳播不均勻的，即在飼料材料中聚集分布，通常情況下只有一小部分樣品被檢測出沙門氏菌陽性（Schelin等，2014），因此取樣需要有代表性，要以合理的精度測量飼料中的微生物含量。

5 展望

生物飼料發酵過程中的菌群變化是影響飼料品質的重要因素之一，在以往生物飼料的研究中，多利用PCR-DGGE技術檢測生物飼料發酵過程中微生物多樣性的變化，分析群落中的優勢種類（許愛清等，2010）。但生物發酵飼料的品質不僅取決于發酵微生物的存在，而主要取決于其數量，特別是發酵微生物初期，應以更可控、可預測的方式給產品提供特定的物質。實時熒光定量PCR具有定量、特異、靈敏快速、自動化程度高等特點，已廣泛應用于醫學、腸道菌群、釀造等領域的菌群變化檢測分析，將其用于生物飼料發酵菌群變化的探究應得到重視，為生物飼料提供重要的檢測工具。

然而實時熒光定量PCR也存在不足之處，使用單一靶基因進行qPCR檢測的一個普遍限制是可能產生潛在的假陽性或陰性，因此建議使用多重熒光定量PCR，把多個遺傳標記作為靶基因，使潛在的假陽性或假陰性結果最小化 （Yong等，2013）。在標準曲線定量中，定量標準物可以是cDNA、質粒DNA等，各個實驗室所用的生成標準曲線的標準品各不相同；此外，由于PCR檢測中的波動，不同PCR檢測的Ct值無法直接比較。在相對定量中，其前提是假設內源控制物表達水平不受外界實驗條件影響，選擇合適的內源控制物也是實驗結果可靠與否的關鍵。發酵菌株的規范化仍是生物飼料的研究核心，同一菌種的不同菌株其功能特性各異，需要進一步的研究來確定靶基因和qPCR檢測方法，使其測定結果特異、定量準確。除了需要設計專門針對目標物種或菌株的引物外，qPCR還受DNA質量和產量的影響，基質中背景DNA的存在可能導致Ct值過高；微生物水平較低時，雖然富集步驟可以提高PCR檢測效率，但會增加微生物的數量，造成計數的不準確（Ehrs等，2011）。為了比較不同的研究，飼料DNA提取和PCR擴增方法應該進一步標準化。若克服這些不足之處，實時熒光定量PCR技術在生物飼料領域將會有更加廣闊的應用前景。