川芎嗪通過調控組蛋白乙酰化修飾上調SERCA2a對心力衰竭小鼠模型的防治機制研究

楊 英， 張文華，丁 銘， 吳 翔

(1.陜西省第四人民醫院重癥醫學科 ,西安 710043; 2.西安交通大學醫學院基礎醫學院,西安 710012)

心力衰竭（heart failure, HF）是以系統性灌注為特征的臨床綜合征，由于心臟功能受損，其不足以滿足人體的代謝需求，全球估計患病率>3 770 萬[1]。盡管實質性療效與基于證據的療法相關，例如血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）、醛固酮拮抗劑和β-腎上腺素能受體阻滯劑（β-受體阻滯劑），但不良的臨床結果仍然是主要公眾健康問題，并且該綜合征的患病率在全球范圍內繼續擴大[2]。因此，急需開發針對新靶標或基于新機制的新型治療藥物。

心肌肌漿網Ca2+-ATPase 2a（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA2a）調節細胞內鈣的處理，在心臟收縮和舒張中起關鍵作用[3]。在壓力超負荷引起的心力衰竭的動物模型中，SERCA2a mRNA和蛋白的表達水平顯著降低[4-5]。因此，通過基因修飾增加SERCA2a 的表達或活性被認為是解決心力衰竭的一種革命性方法[6-7]。研究表明，通過腺病毒基因轉移SERCA2a 在肌細胞中的過度表達導致收縮力增加和瞬時鈣的更快松弛，進而改善壓力超負荷引起的心力衰竭動物的心肌功能[8]。最近，在壓力超負荷引起的心力衰竭小鼠模型中，發現組蛋白表觀遺傳修飾可調節SERCA2a[9]，這表明SERCA2a 的表觀遺傳調控可能代表預防心力衰竭的新機制。

川芎嗪（ligustrazine，LGSZ）已被證明對人類的病理和生理過程，尤其是心血管疾病具有多重影響[10-11]，其注射液臨床防治心力衰竭療效確切，但是，LGSZ預防心力衰竭的表觀遺傳機制仍不清楚，推測LGSZ可能通過調節SERCA2a參與心衰防治。為驗證上述結果，本研究建立心衰小鼠動物模型，探討LGSZ 對SERCA2a 表達的影響及其可能的機制，具體報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年雄性小鼠C57BL/6（8～10周大）購自實驗動物中心。動物飼養和實驗過程遵循中國醫學科學院動物倫理委員會相關規定。將小鼠飼養在單獨通風的籠子中（25℃，濕度55～65%），光照/黑暗周期為12h，自由飲食。將動物隨機分為四組，即假手術組（SHAM）、TAC 組、TAC + LGSZ 組和SHAM + LGSZ 組，每組10 只小鼠。TAC + LGSZ 和SHAM + LGSZ 組的小鼠在手術后每天一次通過腹膜內注射用單劑量（50 mg / kg /天）的LGSZ（阿拉丁，中國）治療，持續12 周。

1.2 儀器與試劑 超聲為加拿大Visual Sonics 公司的Vevo 2100 超聲高分辨率成像系統，圖像拍照采集采用日本尼康DS-Fi3 顯微鏡相機，英國Syngene公司的G-BOX 成像系統UK。

RNA 提取試劑盒（Bioteck，中國），蛋白質提取試劑盒（Key-GEN Bio-TECH，中國），oligo dTadaptor 引物和AMV 逆轉錄酶試劑盒（TaKaRa，日本），SYBR Green Real Master Mix 試劑盒（Tiangen，中國），SERCA2a（Abcam，美國）和GAPDH（Arigo，臺灣），ChIP 分析試劑盒，GATA4 及Mef2c（Abcam，美國），甲醛（SigmaAldrich，美國），HDAC1 活性測定試劑盒（BioVision，美國）。

1.3 方法

1.3.1 微創主動脈縮窄術（transverse aortic constriction，TAC）： 使用微創TAC 方法造模[12]。通過吸入1.5%～2.5%的異氟烷麻醉小鼠，并在整個過程中使用加熱墊保持體溫在36～37℃之間。在胸骨上切跡的水平切出一個長度為7～10 mm 的水平皮膚切口。然后，甲狀腺縮回并且胸骨暴露。在胸骨上切下5mm 的縱向切口，縮回胸腺，以便在低倍放大下觀察主動脈弓。在彎曲的27 號針頭的引導下，將6-0 絲線縫合穿過無名氏動脈和左頸總動脈起點之間的主動脈弓。將另一個27 號針頭放置在主動脈弓旁邊，并將縫合線整齊地綁在針頭和主動脈周圍。結扎后，取下針頭。用4-0 尼龍縫合線縫合皮膚，讓小鼠在加熱墊上干凈的籠子中完全康復。丁丙諾啡每天一次皮下給藥，持續3 天，用于術后鎮痛。觀察動物的術后健康狀況和手術部位，并每天記錄兩次，共7 天，直到縫線被移除，然后每天給藥一次，持續3 個月。

1.3.2 超聲心動圖：使用Vevo 2100 高分辨率成像系統進行超聲心動圖研究。所有測量均由同一人執行。用1.0%～1.5%的異氟烷麻醉小鼠，然后將它們放在加熱墊上。用脫毛膏去除心前區的毛發。拍攝B 模式圖像以測量心室和主動脈結構，拍攝M 模式圖像以測量心室功能。拍攝P 模式圖像以測量血流速度。分析所有數據以評估TAC 效果。手術后3 天，經胸多普勒超聲心動圖檢查TAC 效果。手術后12周經胸腔超聲心動圖檢查后，用異氟烷處死小鼠并收集心臟。

1.3.3 蘇木素-伊紅（Hematoxylin eosin，HE）染色：心臟組織用4g/dl 多聚甲醛固定，用乙醇脫水，包埋在石蠟中，切成5mm 切片，然后用蘇木素-伊紅染色。于400 倍放大下拍攝四組小鼠的心室切片照片（尼康，日本）。

1.3.4 實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）：使用Bioteck RNA提取試劑盒提取總RNA。使用oligo dT-adaptor 引物和AMV 逆轉錄酶試劑盒從500～1 000 ng RNA中逆轉錄cDNA。使用SYBR Green RealMaster-Mix 試劑盒進行RT-PCR 分析，檢測cDNA。量化SERCA2a 的mRNA 表達水平，并以GAPDH標準化樣品中的RNA 水平。SERCA2a 的為5’-T CGACCAGTCAATTCTTACAGG-3’ 和5’-CAGGG ACAGGGTCAGTATGC-3’，GAPDH的引物序列為5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3’ 和5’-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3’。

1.3.5 蛋白質印跡分析：使用Key-GEN Bio-TECH蛋白質提取試劑盒，從心臟組織中提取總蛋白質，然后使用BCA 分析法（BioTeke Biotechnology，中國）進行定量。在12g/dl SDS-PAGE 凝膠上分離總蛋白（每泳道50μg）并轉移到PDVF 膜上。使用SERCA2a 和GAPDH 特異性一抗，通過蛋白質印跡分析與PDVF 膜結合的蛋白質。使用G-BOX 成像系統分析和定量條帶強度。

1.3.6 染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）測定：使用ChIP 分析試劑盒進行ChIP 實驗。心臟組織均質化后，將1g/dl 甲醛添加到樣品中，以使蛋白質與DNA 交聯。然后，使用超聲波（Bioruptor UCD-200）將交聯DNA 片段化成小片段（500～1 000 bp）。使用特異乙酰化組蛋白3（AcH3），H3 中的賴氨酸4（lysine 4 of hisAcH3K4），H3 中的賴氨酸9（AcH3K9），組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylases 1，HDAC1），GATA4 和Mef2c 的單克隆抗體沉淀蛋白質-DNA 復合物。抗RNA 聚合酶抗體用作陽性對照，抗小鼠IgG 用作陰性對照。去除交聯的蛋白質-DNA 復合物，并提取DNA。設計特定的qPCR 引物來確定Atp2a2 近端啟動子區域附近的AcH3，AcH3K4 和AcH3K9 的水平。用于擴增SERCA2a 啟動子的qPCR 引物序列如下：5’-AGC CAAG GACACCAGTGC-3’ 和5’-GGGATAGAGCG CG GAGTT-3’。

1.3.7 HDAC1 活性測定：使用HDAC1 活性測定試劑盒確定HDAC1 活性。簡而言之，在蛋白質提取和蛋白質濃度測量之后，向每個500μl 反應中添加6μl HDAC1 抗體或對照抗體，并將該反應在4℃下孵育過夜。將蛋白質-A / G（25μl）添加到每個反應中，在4℃孵育1h。然后將每個反應在4℃下以14 000×g 離心10s，并棄去上清液。隨后將包含HDAC 分析緩沖液和HDAC1 底物的反應化合物添加到每個反應中，并在37℃下孵育2h，向每個試管中加入20μl 顯影劑，并在37℃下孵育30min。按照說明稀釋AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素）標準品，對于每份100μl 的反應，讀取Ex / Em = 380nm/500 nm 的熒光（SYNERGY / H1 微板讀數器，BioTek）。繪制AFC 標準曲線，并將樣品讀數應用于AFC 標準曲線，以獲得樣品孔中B pmol的AFC。樣本HDAC1 活性的計算如下：HDAC1活性= 2×B / TS（pmol / min / mg = mU），其中B =標準曲線中的AFC 量，T =反應時間= 120min，S =蛋白量。

1.4 統計學分析 使用SPSS 22.0 進行統計學分析，定量數據顯示為均值±標準差（±s）。通過twoway 或 three-way ANOVA 和事后Bonferroni-Dunn檢驗進行比較，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠TAC 術后評估 見圖1。超聲心動圖顯示，TAC 干預前后無名和左頸動脈之間的橫向收縮部位主動脈直徑（圖1A）。TAC 小鼠主動脈解剖圖顯示主動脈狹窄（圖1B）。TAC 組和LGSZ + TAC組主動脈橫徑和血流量比較（圖1D，1C），差異均無統計學意義（t=0.413，0.186，P=0.127，0.216）。

圖1 小鼠TAC 術后評估

2.2 手術前后超聲心動圖參數比較 見表1，表2。術前和術后12 周采用無創超聲心動圖測量來評估心臟壁厚度的變化。與手術前相比，術后12周時TAC 組心臟左心室前壁舒張末期厚度（left ventricular anterior wall diameter，LVAWd）和舒張末期左室后壁厚度（left ventricular posterior wall diameter，LVPWd）的厚度增加，差異有統計學意義（P<0.05），但其他組手術前后比較，差異無統計學意義（P>0.05）。TAC+LGSZ 組手術前后LVAWd，LVPWd，射血分數（ejection fraction，EF）及縮短分數（fractional shortening，FS）比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）。

表1 手術前后超聲心動圖參數比較（±s）

表1 手術前后超聲心動圖參數比較（±s）

項 目SHAM TAC TAC+LGSZ SHAM+LGSZ術前 術后12 周 術前 術后12 周 術前 術后12 周 術前 術后12 周LVAWd(mm) 0.85±0.14 0.91±0.22 0.92±0.31 1.32±0.37 0.90±0.34 1.03±0.36 0.89±0.24 0.94±0.35 LVPWd(mm) 0.91±0.26 0.98±0.32 0.94±0.35 1.30±0.28 0.93±0.29 0.99±0.37 0.93±0.27 0.92±0.31 LVIDd(mm) 3.73±0.38 3.76±0.41 3.73±0.29 4.04±0.35 3.72±0.28 3.80±0.43 3.74±0.42 3.72±0.37 EF(%) 63.48±3.15 62.91±4.54 62.00±2.82 41.37±8.79 63.01±6.77 62.24±7.25 62.25±5.34 61.05±4.73 FS(%) 37.80±3.15 35.71±2.90 38.93±4.22 21.34±4.86 38.52±5.66 36.01±4.97 38.62±5.08 36.92±6.11

表2 手術前后超聲心動圖參數統計學分析

2.3 SERCA2a mRNA 和SERCA2a蛋白檢測結果 見圖2。qPCR 和蛋白質印跡分析結果顯示，TAC+LGSZ 組SERCA2a mRNA 和SERCA2a 蛋 白表達顯著高于TAC 組，差異有統計學意義（t=4.817，3.913，均P<0.05）。

圖2 SERCA2a mRNA 和SERCA2a 蛋白檢測結果

2.4 各組AcH3 和AcH3K9 水平比較 見圖3。TAC 組SERCA2a 的啟動子元件附近的AcH3 和AcH3K9 水平低于SHAM 組，差異有統計學意義（t=2.437，2.918，P=0.024，0.013）。TAC+LGSZ組中總AcH3 和AcH3K9 與SHAM 組比較，差異無統計學意義（t=0.624，1.249，P=0.540，0.228）。

圖3 各組AcH3 和AcH3K9 水平比較

2.5 各組Atp2a2 啟動子附近HDAC1 酶活性和HDAC1 水平比較 見圖4。TAC 組HDAC1 酶活性和HDAC1 水平均高于SHAM 組和TAC+LGSZ組，差異均有統計學意義（t=4.309，2.713，2.812，2.361，P<0.001，0.014，0.012，0.030）。

圖4 各組Atp2a2 啟動子附近HDAC1 酶活性和HDAC1 水平比較

2.6 各組Atp2a2 啟動子區域附近GATA4 和Mef2c 水平比較 見圖5。TAC 組心臟組織中，Atp2a2 啟動子區域附近GATA4 和Mef2c 水平低于TAC+LGSZ 組，差異有統計學意義（t=4.816，5.007，均P<0.001）。

圖5 Atp2a2 啟動子區域附近GATA4 和Mef2c 水平

3 討論

高血壓、冠心病和糖尿病等損害或過度勞累心肌的疾病均可能導致心力衰竭。高血壓是心力衰竭的最重要原因之一，壓力超負荷會使心肌細胞承受較高的機械壓力和神經激素，從而增加心肌質量并導致左心室肥大，進而發展為心力衰竭[13]。盡管多年來已經開發了多種抗心衰藥物，但是在治療該疾病方面療效欠佳。近年來研究發現表觀遺傳調控在心力衰竭中起重要作用，但其具體機制尚不清楚[14]。心臟核心轉錄因子GATA4 和Mef2c 被證明在Atp2a2 轉錄的調控中發揮作用[15]。因此，本研究通過ChIP 測定Atp2a2 啟動子附近轉錄因子結合水平。研究結果表明，TAC 組心臟組織中，Atp2a2 啟動子區域附近的GATA4 和Mef2c 水平低于TAC+LGSZ 組，這可能是由于組蛋白的低乙酰化引起的。LGSZ 處理后，GATA4 和Mef2c 的結合顯著增加，表明LGSZ 可逆轉與Atp2a2 相關的組蛋白乙酰化作用。增加的HDAC1 活性和與編碼SERCA2a（Atp2a2）基因的啟動子結合，可導致組蛋白3 賴氨酸9 的低乙酰化和與該啟動子區域結合的轉錄因子減少。進一步的研究表明，LGSZ 可以抑制HDAC1 的活性和與Atp2a2 近端啟動子區域的結合，以挽救SERCA2a 的低表達并改善心臟功能。

SERCA2a 在調節心臟功能中起關鍵作用，其在心力衰竭中的低表達[16-17]。TAC 可誘發心力衰竭后SERCA2a 的蛋白和mRNA 水平降低。但是，這種下調SERCA2a 的潛在表觀遺傳機制仍不清楚。最近，一項研究表明，在慢性壓力超負荷的條件下，組蛋白修飾在成人鼠左心室SERCA2a 啟動子重編程基礎[16]，提示組蛋白相關的表觀遺傳調控SERCA2a 和表觀遺傳學在心力衰竭病因中的潛在作用。組蛋白表觀遺傳修飾包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和SUMO 化[18-19]。乙酰化是最重要的組蛋白修飾之一，可導致染色質重塑和基因表達的激活。而且，基因近端啟動子附近的乙酰化不足會導致染色質緊縮，并可能影響轉錄因子與近端啟動子關鍵順式元件的結合親和力[20]。在本研究中，我們發現，心力衰竭后，Atp2a2 啟動子區域附近的總AcH3 以及亞型AcH3K9 的結合減少，活性轉錄因子GATA4 和Mef2c 的結合減少。但是，這種模式在AcH3K4 亞型中未觀察到，表明在心力衰竭后SERCA2a 調節過程中H3 乙酰化賴氨酸位點的選擇性控制。

HDAC 可從組蛋白的ε-N-乙酰賴氨酸氨基酸中除去乙酰基，使組蛋白更緊密地包裹DNA。根據與原始酵母酶的序列同源性和域結構，HDAC 可以分為四類。HDAC1 可以增強DNA 和組蛋白之間的靜電吸引力，并增加染色質的緊密度，從而導致基因表達降低。抑制I 類HDAC 可抑制壓力超負荷引起的心室肥大并顯著改善收縮功能[14,21]，表明I 類HDAC 在心力衰竭期間起關鍵作用。本研究結果表明，HDAC1 的活性增加且與Atp2a2 啟動子區域結合，這表明它可能是TAC 誘導的小鼠心衰期間乙酰化過低介導的SERCA2a 下調的原因。LGSZ 臨床防治心力衰竭療效確切，然而其具體機制尚不清晰，本研究發現TAC+LGSZ 組SERCA2a mRNA 和SERCA2a 蛋白表達顯著高于TAC 組，提示LGSZ 可以逆轉TAC 后觀察到SERCA2a 的表達，同時，LGSZ 處理后乙酰化的H3 和H3K9 上調，進一步發現，LGSZ 可以抑制HDAC1 的活性和結合力。

綜上，LGSZ 可以抑制HDAC1 活性，并與編碼SERCA2a 基因的啟動子結合，從而通過增強AcH3 和AcH3K9 與該基因近端啟動子的結合而導致SERCA2a 表達增加，表明LGSZ 通過組蛋白乙酰化的修飾來上調SERCA2a 在壓力超負荷引起的心力衰竭中起預防作用，可能代表了一種心力衰竭治療的新方法。