妊娠糖尿病患者胎盤LPL基因Hind片段多態性與新生兒發生胰島素抵抗風險的相關性研究

丁 潔，何曉一，劉彥君，李 靜

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八七醫院a.婦產科 ;b 內分泌科,陜西寶雞721000)

妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期常見糖脂代謝紊亂疾病，報道顯示GDM發生率可超過14%，GDM 不僅是巨大兒、早產等不良妊娠結局的誘發因素，更可能造成子代胰島素抵抗[1-2]，影響新生兒發育。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是由肌肉脂肪組織合成分泌的限速酶，LPL 活化后能促進TG 水解和HDL-C 水平升高[3]。MA 等[4]報道顯示LPL 基因Hind Ⅲ多態性與2 型糖尿病發病進展相關，動物實驗則顯示LPL 基因Hind 片段多態性可參與脂質代謝紊亂[5]。因而，推測胎盤LPL 可能有助于判斷脂質代謝紊亂和胰島素抵抗風險。本研究納入84 例GDM 與健康孕婦臨床資料，探討胎盤LPL 多態性表達的臨床意義。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 納入2018年4月～2020年4月84例GDM 患者作為觀察組，孕婦年齡29.65±5.43 歲，孕前體重指數21.57±1.66kg/m2；孕周38.75±1.22周；分娩方式：順產37 例，剖宮產47 例；胎兒性別：男性42 例，女性42 例。另納入同期84 例健康孕婦作為對照組。孕婦年齡28.19±6.06 歲，孕前體重指數22.01±1.71kg/m2；孕周39.01±0.98 周；分娩方式：順產29 例，剖宮產55 例；胎兒性別：男性36 例，女性48 例。兩組產婦基本資料差異無統計學意義（均P>0.05）。

納入標準：①GDM 診斷符合美國糖尿病學會推薦標準[6]；②患者臨床資料完整；③均為單胎妊娠。

排除標準：①產婦并發遺傳代謝性疾病者；②肝腎功能嚴重不全者；③產婦并發有原發性糖尿病者。

1.2 儀器和試劑 引物（上海生工生物工程技術服務有限公司提供），Mix dNTP，異戊醇試劑（國藥集團化學試劑有限公司），DNA 試劑盒（艾美捷科技有限公司），KS48+型PCR 擴增儀（冠森生物科技有限公司），Tanon 1600 全自動數碼凝膠圖像分析系統（原平皓生物技術有限公司），西門子ADVIA2400 型全自動血液生化分析儀。

1.3 方法 胎盤LPL 多態性檢測：①胎盤組織獲取：在胎兒分娩后即刻于胎盤母體面取胎盤組織，大小2.0cm×2.0cm×2.0cm，提取標本時注意避開出血和壞死區域，用生理鹽水洗凈晾干，冷凍備用。②總DNA 提取和引物設計：采用氯仿∶異戊醇（24∶1）提取基因組DNA，保存備用。依據Genbank 全序列數據，利用Primer Premier 5.0 設計引物：上游：5’-CTTGGTGAAAGCCCAGTAAC-3’，下 游：5’-TTTAGCCCAGAATGCTCAGG-3’。 ③ PCR反應：PCR反應體系（20μl），包括Mix dNTP 2.5μl，基因組DNA 0.6μl，上下游引物各1.2μl，核酸聚合酶1μl，加雙蒸水至20μl。擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性2min，58℃退火1min，72℃延伸5min，共40 個循環。取PCR反應產物，用1.5g/dl 瓊脂糖凝膠電泳處理。④限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 法： 取PCR 產 物8 μl，10×Hind Ⅲ內切酶2μl，加雙蒸水至20μl，37℃消化6h，2.0g/dl 瓊脂糖凝膠電泳1h 后染色，采用凝膠成像系統分析記錄酶切結果。

胎兒出生后對新生兒進行隨訪，在新生兒出生后4 周采集指尖血3ml，采用全自動血液分析儀檢測空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、餐后2h 血糖（2-hour plasma glucose, 2h PG）、三酰甘油（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC），高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）水平。

1.4 統計學分析 選用SPSS 22.0 軟件包對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間行重復測量的方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，計數資料以（%）表示，組間行χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦胎盤LPL 多態性結果比較 孕婦胎盤LPL 多態性檢測結果顯示，觀察組中，H+H+基因型48 例，H+H-基因型24 例，H-H-基因型12 例。對照組H+H+基因型32 例，H+H-基因型38 例，H-H-基因型14 例。兩組孕婦胎盤LPL 基因型分布比較，差異有統計學意義（χ2=6.52，P=0.04）。

2.2 GDM 不同基因型患者糖脂代謝指標比較 見表1。 GDM 不同基因型患者所生新生兒TC，TG，HDL-C，LDL-C 及HOMA-IR 水平差異均有統計學意義（F=5.29～16.33，均P<0.05）。

表1 GDM 不同基因型患者糖脂代謝指標比較（±s）

表1 GDM 不同基因型患者糖脂代謝指標比較（±s）

項 目 H+H+（n=48） H+H-（n=24） H-H-（n=12） F 值 P 值FPG（mmol/L） 5.41±0.82 5.38±0.86 5.34±0.77 0.04 0.96 HbA1c（%） 6.53±1.76 6.22±1.60 5.67±1.58 1.30 0.28 2h PG（mmol/L） 6.85±1.02 6.75±0.98 6.73±0.93 0.12 0.89 TC（mmol/L） 6.43±0.74 5.98±0.79 5.26±0.82 11.89 <0.01 TG（mmol/L） 3.36±0.69 2.87±0.66 2.19±0.52 16.33 <0.01 HDL-C（mmol/L） 0.93±0.24 1.21±0.31 1.28±0.29 13.39 <0.01 LDL-C（mmol/L） 3.42±0.85 2.67±0.74 2.55±0.69 10.13 <0.01 HOMA-IR 2.26±0.92 1.88±0.83 1.39±0.71 5.29 0.01

2.3 影響HOMA-IR 的多元逐步回歸分析結果 見表2。以84 例GDM 患者所生新生兒的HOMA-IR為因變量，以新生兒TC，TG，HDL-C，LDL-C 及HOMA-IR 為自變量進行多元逐步回歸分析，結果顯示胎盤LPL 多態性是新生兒HOMA-IR 的重要影響因素（t=2.86，P<0.05）。

表2 影響HOMA-IR 的多元逐步回歸分析結果

3 討論

報道證實GDM 患者子代成年后2 型糖尿病風險較正常孕婦的子代顯著增加[7]，而GDM 發病機制復雜，隨著人類基因組計劃的實施和完成，有關GDM 機制的研究已深入基因分子領域。GDM 基因易感性的問題逐漸成為關注焦點。莊麗穎等[8]研究發現脂聯素基因外顯子2 在GDM 患者不同位點存在多態性表現，國內一項報道則發現GDM 患者人白細胞抗原-B41 等位基因頻率與健康正常孕婦水平差異有統計學意義[9]。但因基因高度多態性、單倍型遺傳等因素，可能造成同一基因在不同地區、種族患者中表達差異顯著[10]。因而有關GDM 易感基因的研究尚需完善基因序列，擴大樣本量隨訪觀察，以深入探討。

LPL 是由LPL 基因編碼的糖蛋白，與孕婦和胎兒脂質代謝密切相關。LPL 通過水解乳糜微粒和低密度脂蛋白，促進脂蛋白的轉化，增加母體和胎兒對脂肪酸利用率[11]。朱文芳等[12]還認為LPL 的這種作用隨孕周時間延長而逐漸增強。有關LPL 在GDM 子代并發癥中的作用，臨床也有相關報道。胎盤LPL 表達異常可影響胎兒脂質的轉運代謝過程，進而成為胎兒出生后脂質代謝紊亂的誘因[13]。陳金斌等[14]解釋其機制可能是因活性增強后，使胎兒游離脂肪酸梯度水平相關增加，這直接促進了胰島素細胞的增殖和胰島素的分泌。而LPL 水平異常，則可能造成脂質代謝紊亂和胰島素敏感性降低。李陽雪等[15]動物實驗也說明敲除LPL 基因可成為血脂代謝紊亂和胰島素抵抗的重要原因。

但胎盤LPL 基因型分布是否與GDM 有關尚待研究，本研究發現GDM 與健康孕婦胎盤LPL 基因型分布差異顯著，且胎盤LPL 多態性是新生兒HOMA-IR 的獨立影響因素，提示LPL 多態性不僅與GDM 發病有關，還可能成為子代胰島素抵抗的誘因，進而影響新生兒的生長發育。Hind Ⅲ是LPL 基因常見多態性位點，李丹丹等[16]發現LPL Hind Ⅲ多態性在不同種族人群中存在顯著性差異，而李薪等[17]的研究則說明對于LPL Hind Ⅲ多態性分布可能是脂質代謝紊亂的影響因素。本研究還說明胎盤LPL Hind Ⅲ多態性可能影響GDM 患者子代胰島素抵抗，這可能與LPL Hind Ⅲ多態性的連鎖不平衡機制有關。PEACOCK 等[18]認為H+基因可引起LPL 外顯子結構突變，并造成LPL 基因側翼序列核苷酸異常改變，進而導致LPL 活性降低，功能異常，影響脂質轉運，增加胰島素抵抗發生機率。另外，胎盤LPL 基因轉錄功能受損引起基因型變異也可能是其影響GDM 患者子代胰島素抵抗的原因[19-20]，但這還有待進一步研究證實。

綜上，胎盤LPL 多態性與GDM 發病密切相關，胎盤LPL 基因H+H+基因型患者子代發生胰島素抵抗的風險更高。