耐砷A216T 錯(cuò)義突變型PML-RARα 質(zhì)粒的構(gòu)建及雄黃對(duì)其蛋白產(chǎn)物影響及機(jī)制

潘一鳴 李蕊白 黃子明 劉 宇 費(fèi)明明 陳凌燕 侯 麗

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院血液腫瘤科，北京 100700；2.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035

急性早幼粒細(xì)胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）患者超過90%表現(xiàn)為t（15；17）（q22；q12），產(chǎn)生PML-RARα 融合基因，導(dǎo)致APL 發(fā)生[1]。維甲酸和三氧化二砷靶向PML-RARα 使APL 變得可治愈[2]。但10%的APL 患者在治療后無法獲得長(zhǎng)期生存，耐藥復(fù)發(fā)是主要原因[3]。耐砷APL 患者PML-RARα 存在錯(cuò)義突變，如A216T 等導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變引起耐藥[4-7]。為研究這一問題，本研究構(gòu)建了A216T 突變的PML-RARα 質(zhì)粒（以下簡(jiǎn)稱PMLA216T-RARα，野生型簡(jiǎn)稱為PMLWT-RARα），并研究了砷劑雄黃對(duì)其的影響和相關(guān)機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及試劑

砷劑雄黃（純度≥99%，湖北信康醫(yī)藥化工有限公司，12279-90-2）。引物委托北京擎科生物科技有限公司合成；pCDH-puro 質(zhì)粒由溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol Reagent（Life Technology，B610409-0100）；2×Phanta Max Master Mix（Vazyme，P525-01）；Plasmid Mini Kit（OMEGA，D6943-01）；Gel Extraction Kit（OMEGA，NA1111-1KT）。無縫克隆試劑盒[和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司，M2026]；Lipo fectamineTM3000（Thermo Fisher，L3000015）；PML 抗體（ab96051）、P62 抗體（ab56416）、LC3B 抗體（ab192890）、p-mTOR 抗體（ab109268）、β-actin（ab8226）均購(gòu)于abcam 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HL-60 細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，用含10% FBS 的IMDM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。95D 和A549 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞，分別用含10%的FBS的DMEM 和含10%的FBS 的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)獲得PML 與RARα 的mRNA 序列及其融合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物。95D、A549 細(xì)胞用Trizol 法提取總RNA，擬轉(zhuǎn)錄為cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增目的基因，PML 正向引物：5’-AGAAGATTCTAGAGCTAGGCCACCATGGAGCCTGCACCCGCCCG-3’，反向引物：5’-GCTCTGGGTCTCAATGGTTGCCTCCCCGGCGCCACTG-3’。RARα 正向引物：5’-ACCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTT-3’，反向引物：5’-CGGATCCGATTTAAATTCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCGGGGAGTGGGTGGCCG-3’。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳后用Gel Extraction Kit 回收分別獲得PML 與RARα 的片段。設(shè)計(jì)插入突變用的引物，PMLA216T正向引物：5’-TGCTCGTGCACGCTCCTTGAC-3’，反向引物：5’-AAGGAGCGTGCACGAGCAG-3’。以PML 的cDNA 為模板，用PML 正向和PMLA216T反向引物先進(jìn)行1 次PCR 反應(yīng)，再用PML 反向和PMLA216T正向引物進(jìn)行第二次PCR 反應(yīng)，將兩次PCR 的產(chǎn)物用無縫克隆試劑盒按說明書行無縫克隆，即可獲得PMLA216T片段，再將其與RARα、單酶切后得載體pCDH-puro 用無縫克隆連接即完成質(zhì)粒構(gòu)建。產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 按說明書操作用LipofectamineTM3000 將pCDH-puro-PMLWT-RARα 和PMLA216T-RARα轉(zhuǎn)染至HL-60 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后開始相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 血清饑餓和雄黃對(duì)PMLWT-RARα 和PMLA216TRARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響 HL-60 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用不同濃度的雄黃處理24 h，收集細(xì)胞制樣，Western blot 觀察PML-RARα 和自噬相關(guān)因子的變化。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后用含0、5%、10% FBS 的IMDM培養(yǎng)基處理24 h，Western blot 觀察PML-RARα 和自噬相關(guān)因子的變化。Western blot 步驟：濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 60 min，轉(zhuǎn)膜100 V 120 min，封閉1.5 h，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1 h，曝光顯影。Western blot 結(jié)果用Image J 進(jìn)行灰度值相對(duì)定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

PMLWT-RARα 和PMLA216T-RARα 與已知序列完全符合，其中PMLA216T-RARα 的PML 部分的第216 個(gè)密碼子所對(duì)應(yīng)的3 個(gè)堿基由GCG 變成ACG，相應(yīng)的氨基酸由丙氨酸（A）變?yōu)樘K氨酸（T），突變點(diǎn)位測(cè)序結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2.2 不同濃度雄黃對(duì)PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα的影響

予0.5、1、2、4、8 μmol/L 雄黃處理24 h，結(jié)果顯示：1、2、4、8 μmol/L 雄黃處理后PMLWT-RARα 和PMLA216TRARα 水平低于未經(jīng)雄黃處理（0 μmol/L）的PMLWTRARα 和PMLA216T-RARα 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；0.5 μmol/L 雄黃處理后PMLWT-RARα 水平低于未經(jīng)雄黃處理的PMLWT-RARα 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。相同濃度雄黃處理后PMLA216T-RARα水平高于PMLWT-RARα 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 Western blot 檢測(cè)不同濃度雄黃處理后對(duì)PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα 的影響

2.3 血清饑餓對(duì)PMLA216T-RARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響

5% FBS 和未經(jīng)FBS 處理的PMLA216T-RARα、p-mTOR 水平低于10% FBS 處理的PMLA216T-RARα、p-mTOR 水平，p62、LC3B 水平高于10% FBS 處理的p62、LC3B 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 血清饑餓對(duì)PMLA216T-RARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響

2.4 不同濃度雄黃對(duì)PMLA216T-RARα 水平及自噬相關(guān)因子的影響

予0、4、8、16、32、64 μmol/L 雄黃處理24 h，結(jié)果顯 示：4、8、16、32、64 μmol/L 雄黃處理后PMLA216TRARα 水平低于未經(jīng)雄黃處理的PMLA216T-RARα 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；8、16、32、64 μmol/L雄黃處理后p-mTOR、p62 水平低于未經(jīng)雄黃處理的p-mTOR、p62 水平，LC3B 水平高于未經(jīng)雄黃處理的LC3B 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；16 μmol/L雄黃處理后p-mTOR、p62 水平低于8 μmol/L 雄黃處理后的p-mTOR、p62 水平，LC3B 水平高于8 μmol/L雄黃處理后的LC3B 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 不同濃度雄黃對(duì)PMLA216T-RARα 及自噬相關(guān)因子的影響

3 討論

PML-RARα 蛋白會(huì)使白血病干細(xì)胞分化停滯、凋亡抵抗，進(jìn)行持續(xù)自我更新發(fā)展為APL[8]。維甲酸和三氧化二砷通過靶向PML-RARα 使APL 從高度致死性疾病變成了高度可治愈的疾病[9-12]。以雄黃為主要成分的砷劑復(fù)方黃黛片在APL 治療上被證明不劣于三氧化二砷，還具有口服方便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)[13-16]。近來臨床上發(fā)現(xiàn)部分APL 患者砷劑耐藥，該類患者的PML-RARα 中PML 部分發(fā)生了錯(cuò)義突變，如A216V、A216T、S214L、L217F、S220G 等，這改變了砷結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致耐藥[4-7]。

p-mTOR 是自噬負(fù)調(diào)控因子，下調(diào)該因子會(huì)促進(jìn)自噬。LC3B 參與自噬體的組裝，其水平的高低或LC3B-Ⅰ/LC3B-Ⅱ的比例是檢測(cè)自噬的通用指標(biāo)。p62 是一種與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激、自噬相關(guān)的蛋白，常在應(yīng)激、自噬時(shí)升高，同時(shí)p62 是一種自噬接頭蛋白，通過自身將底物和自噬囊泡上的LC3B 連接，并一起被消化降解，可用來區(qū)分非選擇性或是選擇性自噬[17-19]。

研究結(jié)果顯示PMLA216T-RARα 對(duì)雄黃存在耐藥。有研究顯示自噬可以降解PMLWT-RARα[20]，通過血清饑餓可以使PMLA216T-RARα 水平下降，提示自噬可以降解突變的PMLA216T-RARα。雄黃濃度超過16 μmol/L后，PMLA216T-RARα 下降明顯，伴有p-mTOR 水平下降和LC3B 水平升高，顯示自噬增強(qiáng)，且p62 水平下降，提示增加藥物濃度可以克服耐藥，而16 μmol/L 及更高濃度的雄黃下調(diào)PMLA216T-RARα 水平可能是通過選擇性自噬發(fā)揮作用的。此外，本研究注意到PMLA216TRARα 條帶的上方有一陪行的條帶，趨勢(shì)和PMLA216TRARα 一致，推測(cè)可能是PMLA216T-RARα 的某種聚合體，有待于免疫熒光定位和免疫共沉淀等驗(yàn)證。

既往研究顯示，相比正常成熟粒細(xì)胞，APL 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白低表達(dá)[21-22]，敲除自噬基因Atg7、Atg8后小鼠發(fā)生白血病[23]；用全反式維甲酸和三氧化二砷治療APL 后，自噬相關(guān)通路激活，而阻斷自噬會(huì)降低療效[24-25]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為自噬相關(guān)的因子是PML-RARα 錯(cuò)義突變相關(guān)耐藥問題的潛在靶點(diǎn)，此外提高雄黃濃度也可以克服錯(cuò)義突變相關(guān)耐藥，但如何在更低劑量情況做到這一點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。