低劑量雙酚A 對雌性大鼠心室肌細胞鈣火花的影響及其機制

顏素娟 程曉曙 李菊香 陳亞梅 東 敏 王宏聲

1.首都醫科大學附屬電力教學醫院心內科，北京 100073；2.南昌大學第二附屬醫院心內科，江西南昌 330006；3.辛辛那提大學醫學院，美國俄亥俄州，辛辛那提 45267

1993 年Cheng 等[1]在心肌細胞中發現，雷諾丁受體（ryanodine receptor，RyR）在舒張期處于關閉狀態，但此時依舊能檢測到少量Ca2+從肌漿網通過RyR 漏至胞漿內，這一過程可被共聚焦顯微鏡捕捉到并呈現為火花狀，名為鈣火花。當鈣火花頻率和/或峰值增加，舒張期胞漿內游離Ca2+的濃度就能明顯提高，導致延遲后除極的發生[2]。在日常生活中，從醫療器械到食品包裝的內里，特別是聚碳酸酯及環氧樹脂等材料的生產過程中，通常都會添加雙酚A（bisphenol A，BPA）[3]。且多項研究已經證明BPA 對人體有著各方面的危害[4-8]，本研究以體外分離的雌性大鼠心室肌細胞為研究對象，觀察BPA 是否會影響心室肌細胞鈣火花，并針對其機制進行探討。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

選用20 只10～16 周，體重200～250 g 的二級清潔健康雌性SD 大鼠（Harlan，Indianapolis，IN）作為實驗對象，采用玻璃瓶喂養（Innovive，San Diego，CA）。使用經Millipore Rios 16 及ELIX UV/Progard 過濾后的無BPA 水，并喂食不含有影響大鼠體內雌激素成分的Teklad 飼料2020（Harlen）。動物實驗過程嚴格遵照辛辛那提大學動物實驗管理小組的相關手冊進行，處死方式采用美國獸醫協會專家小組推薦的安樂死。

1.2 主要儀器與試劑

BPA 購自TCI 公司（批號：Cl03105ES），M199 培養液購自Gibco 公司（批號：31100-035），Ⅱ型膠原酶及透明質酸酶購自Worthington 公司。層粘連蛋白（批號：114956-81-9）及Fluo-4 AM 購自Invitrogen 公司。

1.3 實驗分組及處理

1.3.1 心室肌細胞的分離與培養 大鼠麻醉后處死，離體心臟經Langendorff 灌注系統加入Ⅱ型膠原酶及透明質酸酶進行灌注、酶解，然后收集心室肌細胞。將小蓋玻片先用層粘連蛋白覆蓋，再接種細胞懸液，然后將細胞置于37℃，5%CO2的孵箱內生長24 h 后用于實驗。

1.3.2 實驗分組 心室肌細胞按實驗要求分成對照組和BPA 組（添加濃度為10-9mmol/L 的BPA），每組細胞至少來源于3 只大鼠，每只大鼠取8～10 個細胞。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 心室肌細胞鈣火花測量 經Fluo-4 AM 處理后的心室肌細胞見圖1，置于共聚焦顯微鏡（ZEISS，LSM510）的記錄槽內，利用線掃描（100 μm/s），分別記錄對照組及BPA 組的鈣火花，并用軟件IDL6.3 分析數據。

圖1 共聚焦顯微鏡下Fluo-4 AM 處理后的雌性成年大鼠心室肌細胞（40×）

1.4.2 心室肌細胞鈣瞬變測量 心室肌細胞用Fluo-4 AM 處理6 min 后置于槽內。以0.5 Hz 的頻率刺激細胞，利用鈣離子成像系統記錄并保存心肌細胞的鈣瞬變數據，使用軟件clampfit9.2 分析數據。

1.4.3 心肌細胞肌漿網鈣負荷測量 將經Fluo-4 AM處理后的心室肌細胞滴于記錄槽內，對細胞進行電刺激，待細胞鈣瞬變達穩態后，關閉刺激器，迅速加入咖啡因，記錄心室肌細胞的Ca2+濃度變化至其回歸基線，用軟件clampfit 9.2 分析數據。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組鈣火花頻率及峰值比較

共聚焦顯微鏡下可見兩組均有明亮鈣火花出現，見圖2。BPA 組鈣火花頻率高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。兩組的鈣火花峰值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

圖2 兩組雌性大鼠心肌細胞鈣火花示意圖

表1 兩組鈣火花頻率及峰值比較（）

表1 兩組鈣火花頻率及峰值比較（）

注：BPA：雙酚A

2.2 兩組鈣瞬變峰值及tau 值比較

BPA 組鈣瞬變峰值高于對照組，鈣瞬變tau 值短于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 兩組鈣瞬變峰值及tau 值比較（）

表2 兩組鈣瞬變峰值及tau 值比較（）

注：BPA：雙酚A

2.3 兩組穩態下肌漿網鈣負荷及其tau 值和靜態下肌漿網鈣負荷比較

穩態下BPA 組肌漿網鈣負荷高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；兩組的肌漿網鈣負荷tau值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。靜態下，兩組肌漿網鈣負荷比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 兩組穩態下肌漿網鈣負荷及其tau 值和靜態下肌漿網鈣負荷比較（）

表3 兩組穩態下肌漿網鈣負荷及其tau 值和靜態下肌漿網鈣負荷比較（）

注：BPA：雙酚A

3 討論

美國人群的流行病學調查研究發現，95%以上的被調查者尿液中都能檢測到平均濃度為1.33 μg/L 的BPA[9]。Gaynor 等[10]也發現BPA 存在于手術器械中，先天性充血性心力衰竭的新生兒在完成胸外科手術后體內的BPA 濃度明顯升高。目前已證實BPA 是雌激素的內分泌干擾化合物，能通過受體機制模擬/拮抗雌激素的作用。多項研究發現BPA 能促進兒童肥胖，誘發前列腺癌細胞增殖，影響人類生殖系統，導致免疫系統功能異常，造成神經內分泌系統紊亂，改變人類行為等，這一系列不良作用主要是通過基因和受體非基因機制產生[7,11-12]。早在2008 年9 月就有研究報道BPA 與心血管疾病之間有著密切的關系，此后多項研究發現BPA 濃度與心律失常、心源性猝死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛等疾病之間密切相關[13-16]。

胞漿內Ca2+循環在心室肌細胞興奮-收縮偶聯中發揮著重要的介導作用，本課題組既往實驗發現BPA 能增加雌性大鼠心肌細胞的收縮率，濃度為10-9mmol/L時作用最強，而雄性大鼠心肌細胞對BPA 無反應[17]，推測其或許能影響心室肌細胞內Ca2+循環。鈣火花是舒張期自肌漿網內經RyR 流至胞漿的Ca2+漏[1]，是心律失常產生的最根本原因之一[2，18-19]。本研究發現BPA能明顯增加成年雌性大鼠心室肌細胞內的鈣火花頻率，而對鈣火花的峰值無影響。根據鈣火花的形成機制，推測本研究中鈣火花的一系列變化可能是通過增加肌漿網上的RyR 的開放率和/或增加肌漿網內鈣負荷來實現的。

有研究利用二維脂質雙層模擬肌漿網觀察鈣火花的形成，結果顯示局部有多個RyR 通道參與鈣火花的形成[20]。也研究認為鈣火花是局部6～20 個RyR通道同時漏出Ca2+所形成的[21]。RyR 具有3 種異構體，心臟中主要存在RyR2，心肌細胞肌漿網上的RyR2通道異常與心律失常密切相關[22-23]。有研究發現，兒茶酚胺相關性多形性室速患者可以檢測出突變的RyR2基因，利用這一突變基因建立的小鼠模型可誘發出運動相關的心律失常和猝死。實際上目前已有50 余種RyR2 基因突變與遺傳性心源性猝死之間有關聯[24]。而通過穩定RyR2 通道能減少心律失常的發生。最近一種新型藥物JTV519 能穩定狗快速起搏導心衰模型心肌細胞中Calstabin 2 與RyR 的結合，從而減少肌漿網Ca2+漏[25-26]。本研究結果顯示，在BPA 的刺激下，心室肌細胞鈣火花頻率增加，肌漿網內的鈣負荷不變。因此靜息狀態下BPA 可增加心室肌細胞肌漿網上RyR的開放率，使舒張期肌漿網上的RyR 開放增多，影響鈣火花的頻率。

為了更好地模擬大鼠體內的環境，本研究以0.5 Hz的頻率刺激心室肌細胞，待細胞收縮達到穩態后，再測定肌漿網內鈣負荷。此時結果顯示，在BPA 的作用下肌漿網內的鈣負荷量明顯增加。本研究還檢測了心肌細胞的鈣瞬變，結果顯示BPA 能明顯升高鈣瞬變的峰值，并且明顯縮短鈣瞬變tau 值。心肌細胞收縮后，胞漿內Ca2+的移除有兩種途徑，一種是通過肌漿網上的Ca2+-ATP 酶將Ca2+泵回肌漿網內，另一種是通過細胞膜上的鈉鈣交換體將Ca2+泵出細胞外。咖啡因誘導的鈣瞬變時，其能使肌漿網上的RyR 全部開放，所以此時胞漿內的Ca2+主要是通過鈉鈣交換體來移除的。而BPA 并不影響咖啡因誘導鈣瞬變的tau值，推測BPA 不影響鈉鈣交換體的功能。因此BPA可能通過影響Ca2+-ATP 酶，增加每次心肌細胞收縮后進入肌漿網的Ca2+量，導致肌漿網內Ca2+濃度增加。

因此本研究推測BPA 可能通過增加鈣火花的頻率，誘發出延遲后除極，促使雌性大鼠室性心律失常的發生。但本研究僅僅從細胞水平進行實驗，至于在離體心臟甚至在整體動物水平能否造成心律失常，則需進一步的實驗來證實。

綜上，BPA 能通過每次心肌收縮逐漸增加心室肌細胞肌漿網內的鈣負荷，并提高RyR 的開放率，促進心肌細胞舒張期肌漿網的Ca2+漏，增加鈣火花的發生頻率。