石杉堿甲對膿毒癥大鼠腦病的作用機制

周海銀 隆彩霞 羅 蘭 陳艷瑛 劉萍萍 肖政輝 張樹菊

1.湖南省兒童醫院重癥醫學科，湖南長沙 410007；2.湖南省兒童醫院檢驗科，湖南長沙 410007

膿毒癥相關性腦病是一種彌散性腦功能障礙的疾病，曾被稱為“感染中毒性腦病”“膿毒癥腦病”等[1]。自噬是真核生物中一種進化上高度保守的物質分解代謝途徑，參與細胞代謝、蛋白質分泌和細胞介導的免疫反應[2-3]。研究報道，膿毒癥相關性腦病大鼠海馬區神經細胞存在自噬現象[4]，但這種自噬與膿毒癥腦病之間的關系仍不清楚。

石杉堿甲（Huperzine A，HupA）是一種新型石松類生物堿有效單體，具有多靶點作用，除抑制乙酰膽堿酯酶活性外，還能對抗多種因素誘發的氧化應激和細胞凋亡等神經元毒性作用。本研究擬觀察HupA 對膿毒癥大鼠腦病的保護作用，以及HupA 是否通過核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路調節膿毒癥時海馬細胞自噬。

1 方法與材料

1.1 儀器與試劑

HupA（美國Sigma 公司）；細胞裂解液和BCA 蛋白含量測定試劑（江蘇碧云天公司，批號：P0013B，K11606D）；NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1抗體（美國Abcam 公司，批號：ab320376，ab327450，ab326510，ab326327，ab109390）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 動物分組與模型建立

選用健康雄性Wistar 大鼠60 只，體重250～300 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號為：SYXK（湘）2018-0011。大鼠在溫度為22～25℃、相對濕度為55%～60%，12 h/12 h 明暗交替的動物房中飼養。

將Wistar 大鼠按照隨機數字表法分成3 組：假手術組、模型組和治療組，每組20 只。模型組[盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）]。依據參考文獻[5]進行CLP 制作膿毒癥模型。假手術組大鼠盲腸沒有結扎也沒有被刺穿，其余步驟與模型組均相同，治療組術前2 h 大鼠腹腔注射HupA[6]（0.04 mg/kg，1 ml）。本研究中動物處置方法符合動物倫理學3R 標準。

1.3 生理檢查

將大鼠麻醉后，在股動脈內放置留置管，連接iWorx 生物信號記錄儀提供靜脈通道，用于監測術后12 h 各組大鼠平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）和心率（heart rate，HR）。

1.4 HE 染色觀察海馬組織病理改變

建模后第12 小時，取各組大鼠腦組織，于4℃下用4%多聚甲醛固定24 h，行常規蘇木精、伊紅染色[6]，用倒置光學顯微鏡拍攝圖像。

1.5 免疫熒光染色觀察海馬組織中LC3 陽性細胞數

切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液熱修復，洗滌切片，滴加10%山羊血清，37℃孵育1 h，同時滴加兔抗LC3 多克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，洗片后滴加FITC 標記的IgG 熒光二抗，濕孵1 h，觀察采用單盲、雙人計算每個視野陽性細胞個數[7]。

1.6 Western blot 檢測海馬區自噬相關蛋白表達

將海馬組織置于預冷的RIPA 裂解液中進行裂解，用BCA 法檢測蛋白濃度，隨后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h，分別加入NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1 一抗（1∶1000 稀釋），室溫孵育2 h，洗滌，再加入辣根過氧化酶標記的二抗，ECL法顯色，采用凝膠成像技術進行分析[8]。

1.7 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組術后12 h 生命體征

術后12 h 模型組MAP 低于假手術組，HR 高于假手術組（P ＜0.05）。治療組MAP 值高于模型組，HR低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組術后12 h 生命體征比較（）

表1 各組術后12 h 生命體征比較（）

注：與假手術組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；MAP：平均動脈壓；HR：心率。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 HupA 對各組大鼠海馬組織病理學影響

假手術組與治療組海馬神經元基本正常，模型組海馬細胞紊亂，結構不清楚，神經元出現急性創傷性改變，治療組病理改變減輕。見圖1。

圖1 第12 小時各組海馬組織病理學改變（HE 染色，100×）

2.3 HupA 對大鼠海馬組織中LC3 表達的影響

第12 小時，假手術組、模型組和治療組每視野LC3平均陽性細胞數分別為：（3.5±0.3）、（16.8±1.5）、（30.4±2.4）個，治療組LC3 陽性細胞數高于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 各級組海馬組織中 LC3 表達（免疫熒光，400X

2.4 海馬組織中NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1蛋白表達

第12 小時，模型組Beclin1，LAMP-1 和Rab7 表達水平均低于假手術組，NF-κB、LC3 表達水平高于假手術組，治療組Beclin1、Rab7 和LAMP-1 表達水平高于模型組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 石杉堿甲對大鼠CLP 后12 h 海馬LC3、Beclin1、LAMP-1和Rab7 蛋白表達的影響（）

3 討論

膿毒癥發生時線粒體損傷、ATP 生成減少、氧自由基增多等均可導致細胞自噬增多[9-10]。課題組依據文獻[5]建立大鼠膿毒癥模型，生命體征檢測發現：模型組MAP 水平逐漸下降，12 h 到達底部，說明12 h時膿毒癥發病最嚴重，因此后續應對術后12 h 進行研究分析。

HupA 是一種高選擇性、高效的乙酰膽堿脂酶抑制劑，作為治療阿爾茨海默病的潛在藥物備受關注[11-14]。本研究術前2 h 大鼠腹腔注射HupA，治療組MAP 水平高于模型組，而HR 下降（P ＜0.05），提示HupA 能減輕大鼠膿毒癥相關性腦病，生命體逐漸征恢復；HE染色及免疫熒光觀察發現，治療組病理改變減輕，提示腹腔注射石杉堿甲能促進海馬組織細胞自噬，減輕病理性改變。

多種細菌或菌體成分激活巨噬細胞NF-κB 通路是膿毒癥形成的中心環節[15-17]。研究發現隨著NF-κB表達量上調，自噬泡會隨之增加，細胞增殖卻相應減少[18]。LC3 被廣泛用于監測自噬體的形成或指示自噬體[19]，LC3 分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬水平。除LC3 外，Beclin1、Rab7 和LAMP-1在動態自噬過程中起著關鍵作用[20-22]。免疫熒光觀察發現，與假手術組比較，模型組海馬組織中LC3 陽性細胞增多（P ＜0.05），提示膿毒癥使大鼠腦內自噬明顯增加；Western blot 檢測結果，與模型組比較，治療組大鼠NF-κB 蛋白表達下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、LAMP-1、Beclin1 及Rab7 蛋白表達增加。盡管LAMP-1、Beclin1、Rab7 的增加機制尚不清楚，但推測海馬組織神經細胞損傷會進一步增加自噬發生[23-25]，誘導自噬相關蛋白表達。此外，免疫熒光檢測也顯示，與模型組比較，治療組LC3 陽性細胞數增加（P ＜0.05），這些提示石杉堿甲可能通過抑制NF-κB 表達，上調自噬相關蛋白LAMP-1、Beclin1、Rab7 表達，提高自噬發生，發揮腦神經保護作用。

綜上所述，石杉堿甲能抑制NF-κB 表達，促進膿毒癥大鼠海馬自噬的發生，具有神經保護作用，這為膿毒癥腦病提供新的治療策略。