中藥海藻及其提取物抗惡性淋巴瘤作用和機制研究進展

顧恪波 何立麗 張麗娜 吳 潔 孫岸弢 張明輝 張 晨

(1.中國中醫科學院廣安門醫院血液科，北京 100053；2.中國中醫科學院廣安門醫院感染疾病科，北京 100053)

中藥海藻，為馬尾藻科植物海蒿子(大葉海藻)或羊棲菜(小葉海藻)的干燥藻體，《神農本草經》中指出其“味苦寒，主癭瘤氣，頸下核，破散結氣，癰腫癥瘕堅氣”，《名醫別錄》謂之“味咸無毒，主治皮間積聚”，《本草拾遺》載其“主結氣癭瘤是也”。因此，海藻在臨床上常被用于治療癥瘕積聚、腫瘤結塊[1]，尤其是甲狀腺結節和腫瘤[2-3]。現已證實，海藻還可用于惡性淋巴瘤的治療，但其分子作用機制仍不十分清楚，臨床應用受到限制。現將近年來有關海藻及其提取物抗惡性淋巴瘤的作用與機制研究進展綜述如下。

1 以海藻為主的方劑對惡性淋巴瘤的作用

在臨床研究方面，自上世紀80年代起，即陸續有運用中藥海藻抗惡性淋巴瘤的報道[4]。湖南名中醫潘敏球先生認為，惡性淋巴瘤多因肝腎陰虛，虛火內動，灼津煉痰，致使痰火凝結而成，以經典方劑“四物湯”合《醫學心悟》中的“消瘰丸”加海藻、昆布、黃藥子、山慈菇、重樓等共同組成“加減四物消瘰湯(藥物

組成：當歸、川芎、赤芍、生地黃、玄參、山慈菇、黃藥子、海藻、昆布、夏枯草、牡蠣、重樓)”治療惡性淋巴瘤效果顯著[5]。浙江名中醫趙樹珍先生主張從痰論治惡性淋巴瘤，擅長用海藻、半夏、天南星、夏枯草、山慈菇、牡蠣等化痰軟堅散結之品組成治療基本方，隨癥加減化裁治療惡性淋巴瘤取得了較好療效[6]。孫長勇等[7]以慈菇海藻湯(藥物組成：海藻、山慈菇、昆布、黃藥子、玄參、夏枯草、當歸、川芎、赤芍、生地黃、牡蠣、重樓)配合吉西他濱+地塞米松方案(GDP方案)治療復發難治性淋巴瘤患者43例，并與單純GDP方案治療40例對照。結果顯示，觀察組緩解率(完全緩解+部分緩解)為93.02%，顯著高于對照組(75.00%，P<0.05)；觀察組遠期復發率為9.30%，遠期死亡率為6.98%，均明顯低于對照組(27.50%、22.50%，P<0.05)。由此可見，慈菇海藻湯配合GDP方案化療有較好的增效作用，減少了遠期復發，提高了患者長期生存率。

以海藻為君藥的經典名方“海藻玉壺湯”，始載于明·陳實功《外科正宗》，由海藻、昆布、海帶、貝母、半夏、陳皮、青皮、川芎、當歸、連翹、獨活、甘草共12味藥物組成，是中藥“十八反”配伍禁忌“海藻反甘草”的名方，專為癭瘤類疾病而設，目前動物實驗研究證實其對惡性淋巴瘤也有一定抑制作用。如王業生等[8]通過建立胸腺淋巴瘤小鼠模型，以評估海藻玉壺湯對小鼠體內淋巴瘤的作用。結果顯示，經海藻玉壺湯治療后的胸腺淋巴瘤小鼠腫瘤生長明顯減緩，其瘤體質量與同期模型對照組小鼠比較顯著減輕，腫瘤抑制率高達68.1%；在遠期預后評價方面，未經治療的模型對照組小鼠中位存活時間為11周，而經海藻玉壺湯干預的實驗組小鼠中位存活時間為26周，比模型對照組小鼠存活時間顯著延長。進一步的機制研究發現，海藻玉壺湯能顯著降低腫瘤血流速度和瘤組織的黏度，并降低組織基質金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的含量，增加瘤組織基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、MMP-2及與細胞凋亡相關的Fas蛋白含量，抑制成纖維細胞增殖及Ⅰ～Ⅳ型膠原的分泌[9]，提示海藻玉壺湯能阻止惡性淋巴瘤瘤體內的纖維化從而軟化瘤體，并能抑制瘤體內新生血管的形成，阻止瘤體內細胞外基質沉積，誘導腫瘤細胞發生凋亡。此外，海藻玉壺湯含藥血清還能促進小鼠脾淋巴細胞增殖，提高機體免疫力[9]。

國外研究還顯示，海藻不同溶劑提取物對瑞士雄性白化小鼠道爾頓腹水淋巴瘤(Dalton's ascitic lymphoma，DAL)有一定的抑制作用。研究者用海藻的不同溶劑提取物200 mg/kg干預DAL模型小鼠14 d，并與5-氟尿嘧啶20 mg/kg干預進行對照觀察。結果顯示，與5-氟尿嘧啶組比較，經海藻提取物干預后的DAL模型小鼠腫瘤細胞數量和腫瘤質量顯著降低，小鼠壽命明顯延長[10]。

2 海藻提取物對惡性淋巴瘤的抑制作用

2.1 誘導惡性淋巴瘤細胞凋亡 褐藻多糖(Fucoidan)是一種從褐藻細胞外基質[11]中分離出來的主要硫酸多糖類成分，在海蒿子[12]和羊棲菜[13]中也均含有。研究表明，Fucoidan可誘導原發性滲出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)、彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)及人淋巴瘤細胞系HS-Sultan細胞凋亡[14-16]。

PEL是一種罕見的惡性侵襲性B淋巴細胞腫瘤，其發病人群多為老年人或免疫功能低下者，發病與人類皰疹病毒8型感染有關，通常表現為體腔內惡性滲出，卻見不到實體瘤塊。目前PEL沒有很好的治療方案，大多數患者在一線治療后6～8個月內復發[17]，1年總生存率僅為30%[18]。研究表明，PEL細胞經2、4 mg/mL濃度的Fucoidan處理后，G1周期細胞的百分比可由未處理的52.1%分別增加到59.6%和69.3%，S周期細胞的百分比可由未處理的30.5%分別下降到22.1%和7.5%[14]，提示Fucoidan可通過誘導PEL細胞在G1周期阻滯，而呈劑量依賴性的抑制PEL細胞增殖。此外，Fucoidan還可通過增強半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8(caspase-8)及caspase-9的活化，進而激活效應caspase-3而誘導PEL細胞凋亡，卻少有嚴重的毒副作用[14]。

DLBCL是成人最常見的侵襲性B淋巴細胞腫瘤，占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)的40%，占所有淋巴瘤的30%[19]。根據基因表達譜的特點，DLBCL可分為三大類，即生發中心B細胞樣DLBCL、活化B細胞樣DLBCL和原發性縱隔大B細胞淋巴瘤或未分類的亞型[20-22]。盡管聯合化學和免疫治療可提高DLBCL患者的總體生存率，但有超過30%的患者復發或發展為難治性淋巴瘤[23-25]。研究表明[15]，Fucoidan在體內和體外對DLBCL均有劑量和時間依賴性抑制作用，可引起G0/G1細胞周期阻滯，并可誘導DLBCL細胞凋亡，在此過程中Fucoidan可誘導DLBCL細胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3活化，并誘導DNA修復酶多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白裂解，使細胞線粒體膜電位喪失，細胞色素C和凋亡誘導因子從線粒體釋放到細胞質中，從而激活DLBCL細胞凋亡。

對人淋巴瘤細胞系HS-Sultan細胞，Fucoidan同樣具有抑制增殖和誘導凋亡的作用。研究發現，經Fucoidan處理24 h后，HS-Sultan細胞線粒體膜電位降低，caspase-3激活，從而通過線粒體途徑誘導淋巴瘤細胞凋亡[16]。

2.2 增強蛋白酶體抑制劑的殺傷活性 在真核細胞中，不穩定的或者變性的、錯誤折疊的蛋白經過泛素活化酶、泛素結合酶、泛素連接酶等共價修飾多聚泛素鏈后，可被26S蛋白酶體識別并降解[26]。而蛋白酶體抑制劑可阻斷這種降解作用，使得這些蛋白在胞內聚集而啟動細胞死亡程序。因此，蛋白酶體抑制劑被用于多種腫瘤的治療。

卡非佐米(CFZ)是26S蛋白酶體不可逆的抑制劑，對多發性骨髓瘤的療效優于硼替佐米[27]，且對套細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤也均有一定的治療作用[28-29]。研究證實，Fucoidan可增強蛋白酶體抑制劑CFZ對DLBCL細胞的殺傷活性[15]，表現出較好的增效作用。目前，聯合化療仍是被廣泛接受的治療DLBCL的一線方案。但有研究顯示，Fucoidan不能增強環磷酰胺、阿霉素、長春新堿、強的松或伏立諾他的療效，卻能顯著增強CFZ的抗DLBCL作用[15]。在該研究中，低濃度的CFZ只能殺死一小部分DLBCL細胞，但當與Fucoidan聯合用藥時，CFZ的抗DLBCL活性顯著增強，即使是低濃度的Fucoidan與CFZ聯合用藥，也可以得到類似的結果。表明CFZ與Fucoidan有協同作用，且CFZ與Fucoidan聯合用藥也增加了對原代DLBCL細胞的細胞毒性，但對正常的CD34+細胞無顯著毒性。

2.3 增強機體免疫活性 實驗研究表明，Fucoidan可通過抑制輔助性T淋巴細胞2 (Th2)相關細胞因子如白細胞介素4(IL-4)和IL-13，增加干擾素γ的表達而增強NK細胞活性，進而發揮對小鼠B細胞淋巴瘤細胞系A20細胞及小鼠淋巴瘤細胞系YAC-1細胞的殺傷活性[30]。

2.4 抑制淋巴瘤細胞增殖與遷移 成人T細胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell eukemia，ATL)是人類T細胞白血病病毒-Ⅰ型(HTLV-1)引起的惡性T細胞單克隆增殖疾病，為一種少見的特殊類型的T細胞受累的淋巴細胞白血病/淋巴瘤，而Fucoidan可以劑量依賴性顯著抑制ATL細胞系的增殖與活力[31]。

3 海藻抗惡性淋巴瘤的機制研究

3.1 抑制核轉錄因子κB/激活蛋白-1/T-LAK細胞來源蛋白激酶(NF-κB/ AP-1/TOPK)信號通路 NF-κB在非激活狀態，與核轉錄因子κB抑制因子α(IκBα)相互作用，使細胞胞漿內未受到刺激的NF-κB處于非激活狀態下。而作為對增生信號刺激的反應，IκBα可通過泛素依賴的蛋白水解過程而被磷酸化和降解，導致NF-κB釋放并形成游離的二聚體，繼而這些二聚體轉移到細胞核內，誘導相應腫瘤基因的轉錄[14]。研究表明，不同濃度的Fucoidan(2、4、6 mg/mL)處理PEL細胞48 h后，即可檢測到Fucoidan呈劑量依賴性地抑制IκBα的磷酸化和降解，同時細胞核內的NF-κB相對含量減少，提示Fucoidan對PEL細胞NF-κB的活性及核轉位均具有抑制作用。在PEL細胞中，AP-1復合物由JunB和JunD 兩種蛋白組成，而Fucoidan可使PEL細胞中AP-1 DNA活性顯著降低，且對JunB和JunD的蛋白表達有劑量依賴性的降低作用[14]。TOPK是一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)樣蛋白激酶，也稱T淋巴因子活化殺傷細胞來源性蛋白激酶，由細胞周期依賴性蛋白激酶1(CDK1)/Cyclin B1復合物激活，可促進細胞分裂，并參與致瘤，是IκBα的上游激酶。TOPK可與IκBα直接作用并磷酸化。而Fucoidan可直接作用于TOPK抑制其活性[14]，另外Fucoidan對TOPK的磷酸化也有抑制作用，但對TOPK蛋白總表達水平無顯著影響。總的來說，Fucoidan可通過抑制IκBα和TOPK的磷酸化，以及AP-1家族蛋白JunB和JunD的表達，來抑制NF-κB、AP-1和TOPK信號通路[10]，下調抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-xL(Bcl-xL)、髓細胞白血病因子-1(Mcl-1)和X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)表達，進而誘導PEL細胞凋亡[14]。

在HTLV-1轉化的T淋巴細胞系和ATL衍生的T淋巴細胞系中，PDZ結合激酶(PBK)/TOPK表達上調并磷酸化,同時能夠磷酸化PBK/TOPK的CDK1/Cyclin B1在這些T淋巴細胞中也呈高表達水平。而Fucoidan可通過抑制PBK/TOPK信號通路呈劑量依賴性的抑制上述T淋巴細胞系的增殖和活力[31]。

3.2 調控細胞周期蛋白 細胞周期蛋白是細胞周期調控的核心分子，它與CDK和CDK抑制因子(CKI)等共同組成細胞周期的調控網絡，以調節細胞的增殖，其調控機制紊亂與腫瘤的發生發展密切相關，在多種惡性腫瘤中呈現高表達狀態，并在腫瘤治療中發揮重要的作用[32]。有研究表明，Fucoidan對多種細胞周期蛋白均具有一定的調控作用[15]。如Fucoidan可使DLBCL細胞的細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6水平顯著降低[15]。p21蛋白屬于CKI 分子之一, 是CDK相互作用蛋白/激酶抑制蛋白(Cip/Kip)家族成員，在控制G1/S周期轉換過程中起重要作用，而Fucoidan可使p21Cip1水平顯著升高[15]。位于染色體13q14的Rb基因，是第一個被發現和鑒定的抑癌基因，由Rb抑癌基因轉錄的Rb蛋白是G1周期躍遷的一個重要檢驗點，而Fucoidan可顯著降低Rb蛋白在其Ser795末端的磷酸化水平，并降低E2F轉錄因子1(E2F1)水平，進而誘導DLBCL細胞發生G0/G1細胞周期阻滯，誘導DLBCL細胞凋亡[15]。

3.3 抑制細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路和糖原合成酶激酶(GSK)磷酸化水平 ERK/GSK3β信號通路在腫瘤的發生、發展中起重要作用，其中GSK3β參與了腫瘤細胞的生長、增殖及轉移、凋亡過程，還與腫瘤化療的耐藥有關，目前被視為惡性腫瘤治療的一個重要靶點[33]。

研究顯示，在Fucoidan處理人淋巴瘤細胞系HS-Sultan細胞24 h后，ERK和GSK磷酸化水平明顯降低，而絲裂原活化蛋白激酶p38和蛋白激酶B(Akt)磷酸化沒有顯著改變，提示Fucoidan可能通過抑制ERK通路和GSK磷酸化水平對人HS-Sultan細胞產生抗瘤作用[16]。

3.4 提高NK細胞活性 T淋巴細胞和NK細胞是機體重要的免疫細胞，參與抗腫瘤免疫調節。研究表明，Fucoidan可提高Th1和NK細胞的免疫活性，增強對小鼠淋巴瘤細胞的抑制作用，介導淋巴瘤細胞破壞[30]。

3.5 調控CXC趨化因子配體12(CXCL12) CXCL12在腫瘤的發展和轉移中起著核心作用。Fucoidan可通過增強與CXCL12的綁定使CXCL12誘導的ERK1/2信號通路受到抑制，進而降低淋巴瘤細胞系Raji細胞趨化性[34]。此外，Fucoidan還通過與CXCL12結合，阻斷CXCL12誘導的其特異性受體CXCR4激活及MMP-9的遷移與分泌等下游效應，從而干擾人Burkitt淋巴瘤細胞中的CXCL12/CXCR4軸而發揮抑瘤作用[35]。

小結綜上所述，無論是以海藻為主藥的方劑還是海藻的有關提取物，均有一定抑制惡性淋巴瘤的功效，其主要作用體現在促進淋巴瘤細胞凋亡、增強蛋白酶體抑制劑殺傷活力、增強機體免疫活性、抑制淋巴瘤細胞增殖和遷移等方面；而其抗惡性淋巴瘤的機制主要體現在抑制NF-κB/AP-1/TOPK信號通路誘導腫瘤細胞凋亡、調控細胞周期蛋白誘導細胞周期阻滯、抑制ERK和GSK磷酸化水平阻斷ERK信號通路、提高NK細胞活性增強機體免疫力、增強與CXCL12的綁定使CXCL12/ERK1/2信號通路或CXCL12/CXCR4軸受到抑制等幾個方面。

目前，海藻在其他各種實體惡性腫瘤中的研究[36-38]非常豐富，包括食管癌、甲狀腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、神經母細胞瘤、肉瘤、腹水瘤等多種惡性腫瘤，其作用機制包括抑制腫瘤細胞增殖、清除誘導腫瘤細胞變化的自由基、促進天然免疫應答、破壞腫瘤細胞骨架及膜通透性、破壞腫瘤細胞的細胞器、激活caspase-3蛋白酶誘導腫瘤細胞凋亡、抗血管生成、栓塞腫瘤滋養動脈及免疫調節等諸多方面。但海藻抗惡性淋巴瘤的作用和機制研究尚處于起步階段，相關研究文獻較少。如以“中國知網”查閱文獻為例，在其官方網站以“篇關摘”搜索引擎搜索“海藻 淋巴瘤”只能查出18條有關內容，其中期刊論文或會議論文僅有11條。在國外網站“PubMed”中搜索“algal and lymphoma(海藻和淋巴瘤)”或“fucoidan and lymphoma(褐藻多糖和淋巴瘤)”，前者僅可得到9篇文獻，后者僅可得到15篇文獻。至于海藻抗惡性淋巴瘤作用效能的評估、毒副作用、量效關系等均需進一步的深入研究加以明確，有關分子機制、作用靶點、如何改善分子結構以增進效能的研究，更需要全面地從細胞、分子、信號、免疫等方面多層次、多角度、多靶點加以闡釋。