解郁化痰法對(duì)慢性不可預(yù)知溫和刺激法誘導(dǎo)抑郁模型大鼠的治療作用及對(duì)海馬區(qū)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷的影響※

李瑞芳 牛燕運(yùn) 劉建平

(1.河北省邯鄲市中醫(yī)院藥劑科，河北 邯鄲 056001；2. 河北省邯鄲市中醫(yī)院心血管科，河北 邯鄲 056001)

冠心病是指因冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄而誘發(fā)的心臟病，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)(PCI)是臨床上治療冠心病的主要方法之一，但由于受患者對(duì)PCI的不了解及對(duì)術(shù)后病情恢復(fù)情況的擔(dān)憂等因素影響，導(dǎo)致部分患者PCI術(shù)后常出現(xiàn)焦慮抑郁的情緒，甚至發(fā)展為PCI術(shù)后抑郁癥，已經(jīng)成為臨床上亟待解決的問題[1]。目前，西醫(yī)臨床對(duì)于PCI術(shù)后抑郁仍以對(duì)癥治療為主，其中氟西汀是臨床上的常用抗抑郁藥，但其藥物不良反應(yīng)多，臨床應(yīng)用受到一定限制[2]。近年來，中醫(yī)藥以多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、副作用小的特點(diǎn)，在抗抑郁治療方面取得了顯著效果[3-4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，抑郁的發(fā)生與氣郁、痰凝有關(guān)，解郁化痰法在治療中風(fēng)后抑郁癥[5]、失眠抑郁[6]等方面均有很好的臨床療效。為進(jìn)一步深入探討解郁化痰法治療抑郁的作用機(jī)制，我們擬通過慢性不可預(yù)知溫和刺激法(CUMS)建立大鼠抑郁模型，觀察解郁化痰丸對(duì)抑郁模型大鼠海馬區(qū)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷影響，以期為臨床上PCI術(shù)后抑郁癥的治療提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度(25±2)℃，濕度(55±10)%，光照周期(12 h/12 h)，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào):SYXK(浙) 2021-0040。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 解郁化痰丸(藥物組成：夏枯草、白芍各9 g，白芷、羌活、秦艽、茯苓、半夏、葛根、煅牡蠣、菊花各6 g，天麻4.5 g。將上述中藥材按量稱取，在研缽中研磨成粉末狀，并用醋調(diào)勻成糊狀，制備成丸劑，所有藥物均購于同仁堂藥房)；氟西汀鹽酸鹽及二甲基亞砜(美國Sigma公司)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.3.1 試劑 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA抽提的試劑Trizol(日本Takara公司)；白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子α(TNF-α)大鼠酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒(美國賽默飛世爾公司)；活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 儀器 FA2004電子天平(北京六一儀器儀表有限公司)；H2050R冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；高溫干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；水浴鍋(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；低速離心機(jī)及ABI Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾公司)；iMarker全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；ENV-250型曠場測試裝置(武漢一鴻科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及造模[7]將40只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、氟西汀治療組、解郁化痰丸治療組。除空白對(duì)照組外，其余3組均采用CUMS建立抑郁癥模型：依次采用夾尾(使用夾尾鉗夾尾大鼠尾尖1 min)、禁食禁水(禁止飲食和飲水24 h)、潮濕墊料(墊料用水泡濕24 h)、籠具傾斜(在鼠籠下放木塊，使鼠籠傾斜24 h)、異物(在鼠籠中放石磚24 h)及異味(在鼠籠中噴灑30%冰醋酸，保持24 h)方式對(duì)大鼠進(jìn)行刺激，每日進(jìn)行1項(xiàng)，輪流進(jìn)行，共連續(xù)刺激6周，大鼠出現(xiàn)明顯的活動(dòng)量下降、攝食量下降、睡眠時(shí)間減少、呆滯等行為改變表示造模成功。

1.4.2 給藥 造模結(jié)束后，給藥劑量按照人與大鼠的比表面積進(jìn)行劑量比換算，氟西汀治療組大鼠予氟西汀藥液20 mg/kg灌胃，解郁化痰丸治療組予解郁化痰丸藥液16 mg/kg灌胃，空白對(duì)照組和模型組分別予等容積0.9%氯化鈉注射液4 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃21 d。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 體質(zhì)量 各組大鼠在灌胃期間每7 d測量1次體質(zhì)量，評(píng)估大鼠體質(zhì)量變化情況。計(jì)算3次平均值。

1.5.2 糖水偏愛實(shí)驗(yàn)[8]各組大鼠在灌胃期間每7 d進(jìn)行1次糖水偏愛實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠興趣變化情況。每只大鼠給予1瓶1%的蔗糖水和1瓶飲用水，記錄大鼠在1 h內(nèi)蔗糖水和飲用水的飲用量，然后依據(jù)計(jì)算公式計(jì)算大鼠對(duì)糖水的偏愛程度。大鼠糖水偏愛百分比(%)=蔗糖水消耗體積/(蔗糖水消耗體積+飲用水消耗體積)×100%。計(jì)算3次平均值。

1.5.3 曠場實(shí)驗(yàn)[9]各組大鼠在灌胃期間每7 d進(jìn)行1次曠場實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠活動(dòng)量變化情況。使用100 cm×100 cm×40 cm的曠場測試裝置，用白線將地面分成25個(gè)方格，每格20 cm×20 cm，四周涂黑，在安靜條件下將大鼠放置于實(shí)驗(yàn)箱中央格內(nèi)，并觀察5 min內(nèi)大鼠在中央格的停留時(shí)間。計(jì)算3次平均值。

1.5.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[10]各組大鼠在灌胃期間每7 d進(jìn)行1次強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠行為絕望狀態(tài)。將大鼠放入水浴鍋中進(jìn)行強(qiáng)迫游泳6 min，記錄大鼠在后4 min內(nèi)靜止不動(dòng)的總時(shí)間，即為行為絕望狀態(tài)時(shí)間。計(jì)算3次平均值。

1.5.5 海馬區(qū)炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo) 灌胃結(jié)束后各組取5只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，分離大鼠大腦海馬區(qū)組織，使用勻漿儀勻漿，隨后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心，吸取上清液，檢測大鼠海馬區(qū)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MAD、SOD及GSH-Px水平，相關(guān)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.6 海馬區(qū)損傷情況 通過檢測海馬區(qū)神經(jīng)元蛋白激酶C(PKC)及肌醇三磷酸(IP3)基因表達(dá)情況評(píng)估海馬區(qū)損傷情況。灌胃結(jié)束后各組取5只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，分離大鼠大腦海馬區(qū)組織，各組取100 mg海馬區(qū)組織于液氮中，在研缽中充分粉碎，加入Trizol 1 mL，4 ℃裂解15 min，按照說明書操作提取組織總RNA。用1000 ng的總RNA于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA(cDNA)，反轉(zhuǎn)錄體系見表1，設(shè)置PCR儀參數(shù)25 ℃，5 min，42 ℃，1 h，70 ℃，5 min。結(jié)束后將cDNA樣品取出，放入多功能酶標(biāo)儀中檢測cDNA濃度。然后使用ABI Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin作內(nèi)參照，采用2-△△CT法分析樣品的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由美國Invitrogen公司合成，引物序列見表2。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

表2 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、糖水偏愛百分比、中央格停留時(shí)間及行為絕望狀態(tài)時(shí)間比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)，糖水偏愛百分比減小(P<0.05)，中央格停留時(shí)間和行為絕望狀態(tài)時(shí)間均增加(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠體質(zhì)量均增加(P<0.05)，糖水偏愛百分比均增大(P<0.05)，中央格停留時(shí)間和行為絕望狀態(tài)時(shí)間均減少(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠體質(zhì)量高于氟西汀治療組(P<0.05)，糖水偏愛百分比大于氟西汀治療組(P<0.05)，中央格停留時(shí)間和行為絕望狀態(tài)時(shí)間均少于氟西汀治療組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠體質(zhì)量、糖水偏愛百分比、中央格停留時(shí)間及行為絕望狀態(tài)時(shí)間比較

2.2 各組大鼠海馬區(qū)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬區(qū)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較

2.3 各組大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MAD、SOD及GSH-Px水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)ROS及MAD水平均升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均降低(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠海馬區(qū)ROS及MAD水平均降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均升高(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠ROS及MAD水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均高于氟西汀治療組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MAD、SOD及GSH-px水平表達(dá)情況比較

2.4 各組大鼠海馬區(qū)PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠海馬區(qū)PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠海馬區(qū)PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平情況比較

3 討論

PCI術(shù)后抑郁癥發(fā)生的原因十分復(fù)雜，有研究報(bào)道認(rèn)為PCI術(shù)后焦慮抑郁的發(fā)生與患者的年齡、學(xué)歷、不良生活嗜好、基礎(chǔ)病情況、既往PCI史、手術(shù)時(shí)長、支架置入數(shù)量及醫(yī)保報(bào)銷情況等有關(guān)[14]。PCI術(shù)后抑郁癥的發(fā)病機(jī)制至今也沒有明確的定論，除了單胺假說、受體假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說和神經(jīng)可塑性假說以外，Maes M等[15]還提出了抑郁癥的細(xì)胞因子假說，其通過論證發(fā)現(xiàn)抑郁癥的發(fā)生往往伴隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，炎癥因子分泌增多和氧化應(yīng)激指標(biāo)平衡失調(diào)導(dǎo)致大腦組織持續(xù)的慢性損傷，從而引起抑郁癥相關(guān)的行為改變。CUMS建立的大鼠抑郁模型就是通過模擬人類生活中的一些不良事件，通過改變大鼠的生活環(huán)境、飲食條件及疼痛刺激等方式，給大鼠大腦產(chǎn)生持續(xù)的應(yīng)激，促炎癥細(xì)胞因子的釋放，降低腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平，從而導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)焦慮抑郁的行為[16]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)，糖水偏愛百分比減小(P<0.05)，中央格停留時(shí)間和行為絕望狀態(tài)時(shí)間均增加(P<0.05)，提示模型組大鼠在飲食、興趣、活動(dòng)量及行為絕望狀態(tài)上均出現(xiàn)了明顯的變化。

海馬區(qū)是機(jī)體大腦的一個(gè)重要區(qū)域，能幫助機(jī)體進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶等，處理日常生活中的短期記憶。在許多結(jié)構(gòu)影像學(xué)和病理解剖學(xué)中發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者會(huì)出現(xiàn)以海馬區(qū)為主的邊緣結(jié)構(gòu)神經(jīng)減退等現(xiàn)象，在抑郁癥發(fā)病的過程中海馬區(qū)的功能嚴(yán)重減退，重病者可出現(xiàn)體積明顯減小[17]。炎性反應(yīng)本是機(jī)體對(duì)外界環(huán)境刺激的一種防御反應(yīng)，但過度的炎性反應(yīng)往往會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織產(chǎn)生損傷，IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α都是臨床上常見的炎癥因子，也是引起大腦海馬區(qū)產(chǎn)生損傷的重要誘導(dǎo)因子[18]。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的狀態(tài)，氧化應(yīng)激損傷與機(jī)體的衰老及許多病理過程相關(guān)，當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)高活性的自由基如 ROS、MAD等產(chǎn)生過多，一旦超出SOD、GSH-Px等抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，就會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[19]。PKC廣泛存在于細(xì)胞和組織內(nèi)，正常狀態(tài)下無表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后PKC被激活，并可伴隨Ca2+釋放到細(xì)胞膜上，而IP3可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放，在激活PKC過程中起重要作用，兩者可作為神經(jīng)元損傷的定量生化指標(biāo)[20]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MAD水平均升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均降低(P<0.05)，PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平均升高(P<0.05)，提示模型組大鼠海馬區(qū)出現(xiàn)了明顯的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，并導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷。

抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)郁證的范疇，認(rèn)為其發(fā)病主要與氣機(jī)不暢有關(guān)[21]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝主疏泄，調(diào)情志，情志不遂，導(dǎo)致肝失條達(dá)，疏泄失司，肝郁氣滯，又橫逆克犯脾胃，脾失升清，胃失和降，氣機(jī)升降失常，水濕津液失于運(yùn)化敷布，則聚濕成痰，氣郁痰凝，蘊(yùn)結(jié)中焦，導(dǎo)致心神受損，清竅失養(yǎng)，臟腑氣血陰陽失調(diào)而成郁證。解郁化痰丸出自清·梁希曾的《疬科全書》，具有解郁化痰的功效，方中半夏枯草清肝散結(jié)解郁；白芍養(yǎng)血柔肝斂陰；白芷祛風(fēng)燥濕活血；羌活、秦艽解表散寒祛風(fēng)；茯苓滲濕利水寧心；半夏燥濕化痰消痞；葛根升陽解肌除煩；煅牡蠣斂陰潛陽化痰；菊花疏風(fēng)清熱平肝；天麻行氣活血熄風(fēng)。上述藥物配伍使用，共奏疏肝理氣解郁、化痰散結(jié)安神的功效。氟西汀屬于選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑，可以阻斷突觸前膜對(duì)5-HT的再攝取，延長和增加5-HT的作用時(shí)間，從而產(chǎn)生抗抑郁作用[22]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠體質(zhì)量均增加(P<0.05)，糖水偏愛百分比均增大(P<0.05)，中央格停留時(shí)間和行為絕望狀態(tài)時(shí)間均減少(P<0.05)，海馬區(qū)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MAD水平均降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均升高(P<0.05)，PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠體質(zhì)量、糖水偏愛百分比、中央格停留時(shí)間及行為絕望狀態(tài)時(shí)間改善均優(yōu)于氟西汀治療組(P<0.05)，海馬區(qū)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、ROS、MAD水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均高于氟西汀治療組(P<0.05)，PKC及IP3基因相對(duì)表達(dá)水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)。提示氟西汀和解郁化痰丸兩者對(duì)抑郁模型大鼠均有確切的治療作用，可明顯改善大鼠的飲食、興趣、活動(dòng)量及行為絕望狀態(tài)，抑制海馬區(qū)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，減輕海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，其中解郁化痰丸的治療效果更佳。

綜上所述，解郁化痰法可以有效緩解抑郁模型大鼠的抑郁行為，增加體質(zhì)量，其作用機(jī)制可能與抑制大鼠海馬區(qū)炎性反應(yīng)，提高抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善抑郁癥狀的作用，為臨床上PCI術(shù)后抑郁癥的治療提供了新思路。