VEGFR-3、APC、P53蛋白在胃癌及癌前病變中的表達及與淋巴結轉移的相關性分析

張 輝，金 瑞，鄭鸞鸞，毛渭東

胃癌為臨床常見的一種惡性腫瘤，在我國其發病率及病死率居惡性腫瘤第一位[1-2]，因此，在早期對胃癌進行及時診斷和治療有利于提高患者存活率。目前，對胃癌的早期診斷主要依賴于對胃癌前期變化的隨訪[3]，而癌前期變化又包括癌前疾病和癌前病變，癌前疾病包括萎縮性胃炎和胃腺瘤，癌前病變包括腸上皮化生和不典型增生[4-5]。由于胃癌通常是一個多階段和多步驟的發展過程，且胃黏膜上皮細胞的增殖分化一般處于動態平衡的狀態，其中這種平衡的維持主要作用于癌基因、抑癌基因和一些生長因子的調控[6]。研究顯示，抑癌基因(P53)具有致癌作用[7]，已有研究報道其在胃癌組織中呈高表達[8]，但相關基因在胃癌癌前病變中表達情況的報道較少。本研究主要檢測血管內皮生長因子受體-3(VEGFR-3)、結腸腺瘤性息肉病(APC)蛋白和P53蛋白在胃癌及癌前病變中的表達情況，并分析其與胃癌淋巴結轉移的相關性，探討其在胃黏膜病變形成過程中的作用及對胃癌早期診斷的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年3月—2020年3月于我院行胃切除及胃鏡活檢標本130例，男73例，女57例；年齡33～73(60.32±10.45)歲；病理組織學類型：腸上皮化生35例，異型增生42例，胃癌53例。納入標準：患者均表現為不同程度的腹脹、腹痛、惡心、噯氣、嘔吐或反酸等；臨床資料相對完整；對本研究知情且簽署知情同意書者。排除標準：既往做過胃相關手術者；接受過化療、放療或免疫治療者；正在服用激素、非甾體類消炎藥、免疫抑制劑、前列腺素及類似藥物者；2周內服用質子泵抑制劑、鉍劑、抗生素等抗幽門螺桿菌藥物。選取胃癌手術標本斷端正常胃黏膜組織32例作為對照組，男18例，女14例；年齡32～73(59.15±10.87)歲。胃癌、癌前病變及正常胃黏膜患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法 將所有標本放入10%中性甲醛溶液中固定，然后用石蠟包埋進行切片，采用免疫組織化學(IHC)檢測各組織中VEGFR-3、APC和P53蛋白的表達情況。IHC具體操作步驟：采用二甲苯對切片進行脫蠟，然后按由低到高的順序將其放入不同濃度的乙醇中脫水，蒸餾水沖洗3次，每次3 min，待充分水化后，用PBS洗3次，每次5 min，將玻片周圍擦干后，加入3%過氧化氫抑制內源性過氧化物酶10 min，再用PBS洗3次，每次5 min，將玻片周圍擦干后，室溫下滴加20%正常羊血清封閉30 min，然后滴加適當比例的一抗，于37 ℃下孵育1～2 h或4 ℃過夜，再用PBS洗3次，每次5 min，再加入Envision試劑(HRP/R)，放入37 ℃恒溫箱中30 min，用PBS洗3次后，再用DAB進行顯色，蘇木素復染，用中性樹膠封片。

1.3結果判定 每張切片均安排兩名不知患者臨床病理資料的病理醫師進行判讀，依照Fromowitz綜合計分法[9]，結合細胞著色強度和陽性著色細胞所占百分比進行綜合判定，其中細胞著色強度判定標準：棕褐色計3分，棕黃色計2分，淡黃色計1分，不著色計0分。陽性細胞百分數為10個視野陽性細胞的平均數占這10個視野中細胞數的百分比，評分標準：>75%計4分，50%～75%計3分，25%～50%計2分，5%～25%計1分，≤5%計0分。最后將二者積分相加，0～2分為陰性，>2分為陽性。其中陽性對照為已知陽性的胃癌組織切片，陰性對照用PBS代替一抗。

1.4觀察指標 統計不同胃黏膜組織中VEGFR-3、APC和P53蛋白表達情況；收集胃癌患者的各項臨床資料，包括性別、年齡、鏡檢獲取的腫瘤直徑、分化程度、臨床分期和淋巴結轉移情況等。

1.5統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，采用多因素Logistic回歸分析胃癌淋巴結轉移的危險因素。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1VEGFR-3、APC、P53蛋白在不同胃黏膜組織中的表達情況 VEGFR-3和P53蛋白在胃癌組織中的陽性表達率高于異型增生、腸上皮化生和正常胃黏膜組織，且在異型增生組織中的陽性表達率高于腸上皮化生和正常胃黏膜組織(P<0.05)。APC蛋白在胃癌、異型增生和腸上皮化生組織中的陽性表達率低于正常胃黏膜組織(P<0.05)，而在胃癌、異型增生和腸上皮化生組織中的陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 VEGFR-3、APC、P53蛋白在不同胃黏膜組織中的表達情況[例(%)]

2.2胃癌淋巴結轉移的單因素分析 53例胃癌中，28例發生淋巴結轉移。單因素分析顯示，腫瘤直徑、分化程度、臨床分期、VEGFR-3陽性表達與胃癌淋巴結轉移有關(P<0.05,P<0.01)，而性別、年齡、腫瘤位置、APC和P53蛋白表達與淋巴結轉移無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 53例胃癌淋巴結轉移的單因素分析[例(%)]

2.3胃癌淋巴結轉移多因素Logistic回歸分析 將上述單因素分析顯示差異有統計學意義的因素納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示分化程度為低中分化、臨床分期為Ⅲ/Ⅳ期、VEGFR-3陽性為胃癌淋巴結轉移的獨立危險因素(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 胃癌淋巴結轉移危險因素多因素Logistic回歸分析

3 討論

胃癌的發生與發展通常涉及多方面的因素[10]，其病理進展順序多為正常胃黏膜、淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生、胃癌[11-13]。另外也有學者證實癌組織通常由腸上皮化生發展而來[14]，因此認為可將腸上皮化生作為胃癌癌變過程中的一個重要環節，不過目前尚缺乏腸上皮化生在胃癌癌變過程中起作用的分子生物學直接證據[15]，因此本研究探討幾類不同類型的基因在胃癌及癌前病變中的表達情況。

由于VEGFR-3信號通路在腫瘤發生的病理過程中調控腫瘤淋巴管的發育及增殖[16-17]，故本研究通過IHC法對VEGFR-3蛋白在胃癌組織及癌前病變中的表達水平進行檢測，結果顯示VEGFR-3蛋白在胃癌組織的陽性表達率高于異型增生、腸上皮化生和正常胃黏膜組織，與修麗娟等[18]研究結果一致，說明VEGFR-3參與胃癌發生的病理過程。另外在臨床上，通常認為結腸家族性腺瘤樣息肉癌變與APC基因異常有關[19-20]，不過，近年隨著對該基因研究的深入，發現其除與結腸癌的發生有關外，同時還對胃癌的發生和發展起重要作用[21]，因此本研究對該基因在胃癌組織中的表達進行研究，發現APC蛋白在胃癌、異型增生和腸上皮化生組織中的陽性表達率低于正常胃黏膜組織，而在胃癌和癌前病變組織中的陽性表達率比較差異無統計學意義，表明在癌前病變胃黏膜組織中APC基因已出現異常表達，可見APC基因在胃癌的早期階段即參與了胃癌的發生。P53是由10個內含子和11個外顯子組成的腫瘤抑制基因[22-23]。有研究已證實P53基因的突變是胃癌發生的原因之一，具有致癌作用[24]。本研究結果顯示，P53蛋白在胃癌組織中的陽性表達率高于異型增生、腸上皮化生和正常胃黏膜組織，提示P53與胃癌的發生關系密切，而P53蛋白在異型增生組織中的陽性表達率高于腸上皮化生和正常胃黏膜組織，進一步說明該蛋白的過表達在胃癌的發生、發展過程中均起重要作用。

本研究單因素分析結果顯示，腫瘤直徑、分化程度、臨床分期、VEGFR-3陽性表達與胃癌淋巴結轉移有關，而性別、年齡、腫瘤位置、APC和P53蛋白表達與淋巴結轉移無相關性。多因素Logistic回歸分析結果顯示，分化程度為低中分化、臨床分期為Ⅲ/Ⅳ期、VEGFR-3陽性為胃癌淋巴結轉移的獨立危險因素。OZMEN等[25]研究表明，VEGFR-3的表達與胃癌淋巴結轉移有關。不過本研究也具有一定局限性，即所納入樣本量較小，同時無癌前病變的跟蹤隨訪資料，所采用的試驗方法也較簡單，可能受影響因素較多，在廣泛應用于臨床之前，還需進一步研究。

綜上所述，VEGFR-3和P53蛋白在胃癌及癌前病變組織中陽性表達率高，認為P53和VEGFR-3的過度表達是胃癌發生過程的較早期事件，APC蛋白陽性表達率低，可將其作為臨床輔助診斷指標，且VEGFR-3與胃癌淋巴結轉移密切相關，可用于評估胃癌的發生、發展。