結直腸癌差異基因篩選及功能預測*

谷媛，項榮武，翟玉萱，魏峰，楊雪瑩，關婷婷，李曉慧，韓濤

（1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽110016；2.北部戰區總醫院 醫療保障中心醫學信息數據室，遼寧 沈陽110003；3.中國醫科大學附屬第一醫院 腫瘤二科，遼寧 沈陽110000）

結直腸癌又稱大腸癌，是最常見惡性腫瘤之一，在消化道腫瘤中，其發病率僅次于胃癌，并呈逐年上升的趨勢。發生結直腸癌的危險因素包括飲食、肥胖、抽煙、運動量不足等，患有炎癥性腸病（潰瘍性結腸炎或克羅恩病）者患結腸癌的風險明顯增加[1-2]。結直腸癌治療方式包括手術、放射治療、化學治療、靶向治療，然而其發病機制復雜，臨床對于其病因研究仍在不斷的探索中。由于結直腸癌早期癥狀不明顯，且缺乏早期診斷的生物標志物，多數患者確診多為中晚期，5年生存率僅為15.8%～27.9%，嚴重威脅患者的生命健康[3]。而早期檢測為結直腸癌患者的存活率約為晚期癌癥的5 倍。因此，尋找新的、早期診斷的結直腸癌腫瘤標志物至關重要。有研究表明，多種mRNA 參與結直腸癌發生、發展過程。本研究基于美國癌癥腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數據庫對結腸癌組織及正常組織中的差異表達基因進行篩選，并探討其相關分子機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據提取

從TCGA 數據庫（https://www.cancer.gov）下載所有結直腸癌mRNA 轉錄組數據,數據均為原始Count數據。將下載的轉錄組數據轉移至同一目錄，然后將數據整合處理成包含樣本ID、樣本名、患者一般資料、生存資料等數據的矩陣，共包含樣本740 例，其中，結直腸癌組織有571 例，正常組織有169 例。

1.2 差異表達分析

對mRNA 轉錄組數據進行正常組織與癌癥組織的差異表達分析。將整理后的數據導入R 語言，利用edge R 工具包讀取文件，校正因子、估算變異系數、計算出所有數據的倍數變化（fold change, FC）值以及偽發現率（false discovery rate, FDR）。然后，篩選出FC 值＜1，且P＜0.05 的mRNA 作為正常組織與癌組織有表達差異的基因，輸出差異基因校正后表達值。FC 值＞0 的基因為上調基因；FC 值＜0 的基因為下調基因。最后，根據edge R 工具包篩選出的結果將所有的mRNA 轉錄組數據所對應的FC 值以及P值取以10 為底數的對數后，以-log10（FDR）為橫軸，以log10（FC）為縱軸，對所有的mRNA 轉錄組數據進行散點圖及熱圖繪制。本次計算的篩選條件：FC=1，P=0.05。

1.3 GO及KEGG信號通路分析

為探討篩選出的差異基因的具體作用及通路，將根據測序分析FC 值篩選出的差異基因導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），設定篩選條件。最后將具有統計學意義的GO 及KEGG 富集通路作為差異基因的富集通路。注意KEGG 富集通路的篩選條件為P＜0.05。

1.4 關鍵基因篩選

由于mRNA 直接調控特定蛋白的合成，所以基于這些mRNA 差異表達基因，研究其相對應的蛋白的相互關系是必要的。通過STRING 數據庫（https://string-db.org/）對FDR 值前200 個的mRNA 差異基因進行分析，構建蛋白互作網絡圖。采用Cytoscape 3.4.0 軟件對蛋白互作網絡進行可視化并調整圖片格式。在R 語言環境下，將網絡節點從高到低排序，篩選出節點排在前7 位的mRNA 作為結直腸癌研究的關鍵基因進行分析。

1.5 基因表達水平及生存分析

比較關鍵基因在癌組織及正常組織中的表達水平。以關鍵基因的中位表達水平為界值，將關鍵基因分為高表達組與低表達組，比較高表達組與低表達組的生存情況：以PLKI 相對表達量中位值（7.02）為界，將樣本分為PLK1 高表達組（n=135）與PLK1 低表達組（n=134）；以SUV39H1 相對表達量中位值（7.28）為界，將樣本分為SUV39H1 高表達組（n=181）與SUV39H1 低表達組（n=181）；以HIST2H4B 相對表達量中位值（8.66）為界，將樣本分為HIST2H4B 高表達組（n=180）與HIST2H4B 低表達組（n=181）。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件及R 語言軟件包處理數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制關鍵基因高表達與低表達的生存曲線，比較采用Log rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異基因篩選結果

根據差異基因的篩選條件，共篩選出5 073 個差異表達基因，其中，上調基因2 136 個，下調基因2 937 個。見圖1、2。

圖1 基因差異表達散點圖

2.2 GO及KEGG富集分析結果

GO 分析結果顯示，其生物過程主要在細胞增殖（GO：0008283）、轉運（GO：0006810）、rRNA 加工（GO：0006364）、受體介導的內吞作用（GO：0006898）等功能富集（見圖3 和表1）。KEGG 富集分析結果表明，差異表達基因的信號通路主要有細胞周期、轉錄失調、膽汁分泌、甲狀腺激素、血小板活化等信號通路（見表2 和圖4）。

表2 KEGG富集分析列表（前5）

圖4 差異表達基因KEGG信號通路分析結果

表1 差異表達基因GO富集列表（前4）

圖3 差異表達基因GO分析結果

2.3 蛋白互作網絡結果

圖2 基因差異表達熱圖

STRING 數據庫分析結果顯示，共發現115 個節點蛋白和99 條相互作用網絡，其中PLK1 蛋白在網絡圖中處于核心地位。將網絡節點從高到低排序，篩選出節點排在前7 位關鍵基因分別為PLK1、BRD4、EHMT2、HIST2H4B、PRPF19、SUV39H1、TRIM28。見圖5。

圖5 蛋白互作網絡圖

2.4 關鍵基因表達水平驗證

癌組織PLK1 相對表達量為（7.04±0.53），正常組織為（6.16±0.30），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.707，P=0.000），癌組織高于正常組織。癌組織PRPF19 相對表達量為（1 963.45±513.12），正常組織為（1 169.50±343.43），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.272，P=0.000），癌組織高于正常組織。癌組織SUV39H1 相對表達量為（7.22±0.38），正常組織為（6.69±0.15），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.144，P=0.000），癌組織高于正常組織。

2.5 關鍵基因生存分析

PLK1 高表達組與PLK1 低表達組5年生存率分別為70.37%（95/135）和60.45%（81/134），經χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=2.972，P=0.087）。SUV39H1高表達組與SUV39H1 低表達組5年生存率分別為58.56%（106/181）和64.64%（117/181），經χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=1.413，P=0.235）。HIST2H4B 高表達組與HIST2H4B 低表達組5年生存率分別為57.22%（103/180）和74.58%（135/181），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=12.113，P=0.001）。

PLK1 高表達組總生存時間為47.25 個月（95%CI：44.146，50.362），PLK1 低表達組總生存時間為42.71 個月（95% CI：39.987，45.434），經Log rank χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=3.957，P=0.083）。SUV39H1 高表達組總生存時間為35.07 個月（95%CI：31.364，38.784），SUV39H1 低表達組總生存時間為33.50個月（95%CI：29.762，37.239），經Log rank χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=0.134，P=0.820）。HIST2H4B高表達組總生存時間為34.32 個月（95% CI：32.841，47.265），HIST2H4B 低表達組總生存時間為41.58 個月（95% CI：38.541，51.517），經Log rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.670，P=0.015），HIST2H4B 低表達組長于HIST2H4B高表達組。見圖6。

圖6 生存曲線圖

3 討論

結直腸癌發生的危險因素多樣。目前通過早期篩查高危人群、改變不良的飲食生活習慣等方式預防直腸癌發病，且可通過靶向治療、化學治療、放射治療、外科手術、免疫治療等綜合方法對其進行治療，但總體預后欠佳。因此，探索與結直腸癌發病機制、預后相關的關鍵分子標志物對其早期診斷及治療十分重要。本研究采用生物信息學方法從TCGA 數據庫中提取571 個結直腸組織樣本，169 個正常組織樣本，經過篩選得到5 037 個差異表達基因，其中上調基因2 136 個，下調基因2 937 個，蛋白互作網絡結果篩選出前7 位關鍵基因為PLK1、BRD4、EHMT2、HIST2H4B、PRPF19、SUV39H1、TRIM28。功能富集分析發現，關鍵基因主要涉及細胞增殖、轉運、rRNA 加工、受體介導的內吞作用；信號通路分析結果顯示，關鍵基因參與細胞周期、轉錄失調、膽汁分泌、甲狀腺激素、血小板活化等過程。進一步生存分析發現，HIST2H4B高表達組與HIST2H4B 低表達組總生存時間有差異。

PLK1 為保守的絲/蘇氨酸激酶家族成員，廣泛存在于真核細胞中，富集在細胞周期通路，參與細胞增殖、有絲分裂細胞周期的G2/M 轉換等生物過程，可直接磷酸化Cdc25 和Cyclin B1，在有絲分裂中起重要作用，其表達量與有絲分裂的活性呈正相關，可能通過P53 信號通路發揮作用[4]。多項研究表明，PLK1 在神經膠質瘤、乳腺癌、甲狀腺癌、結直腸癌、食管癌等癌癥中呈高表達，且其高表達與患者預后相關[5-7]。本研究中，PLK1 在結直腸癌組織中表達顯著上調。HAN 等[8]研究表明，PLK1 在結直腸癌組織中陽性表達，且與Duke 分期、腫瘤大小、浸潤程度、淋巴節轉移有關，PLK1 水平在快速增殖的細胞中普遍升高，PLK1 缺失可抑制結直腸癌細胞SW1116 的遷移和侵襲能力，此外，對PLK1 進行干擾可顯著抑制腫瘤細胞轉移、侵襲。

BRD4 是溴結構域和超末端結構家族成員，在炎癥反應、轉錄調控、細胞周期進展、腫瘤惡性進展等生物過程中發揮重要作用[9]。EHMT2 是組蛋白賴氨酸甲基化轉移酶，在膀胱癌、乳腺癌、神經母細胞瘤等腫瘤中呈現異常高表達，與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學功能有關[10]，但其在結直腸癌中的表達研究較少。SUV39H1 是一種專門負責組蛋白H3K9 三甲基化修飾的組蛋白甲基化酶，催化甲基從s-腺苷蛋氨酸轉移到組蛋白（特別是組蛋白H3 和H4）賴氨酸殘基上，在有絲分裂期定位于著絲粒，在有絲分裂進行中起重要的調控作用，參與異染色質的形成和基因沉默，且H3K9 的甲基化是一個非常保守的表觀修飾，是異染色質形成和轉錄沉默的標志。甲基化的失調在癌癥的發展過程中至關重要。有研究表明，在宮頸癌及卵巢癌組織中Suv39H1 蛋白均呈高表達[11]，且與原發性高草尿癥I 型和視網膜母細胞瘤等疾病進展相關。另有研究表明，SUV39H1siRNA 能抑制急性髓系白血病細胞株KG-1 細胞的增殖，誘導凋亡，有望成為白血病治療的新靶點[12]。TRIM28 是包含多個結構域的大分子蛋白，屬于人類三聚體蛋白家族中的一員，以存在4 個保守結構域即RING 指和B-box 1 型、2 型及亮氨酸卷曲螺旋結構為主要特征。TRIM28 主要與含KRAB 結構域的轉錄因子相互作用，從而發揮轉錄共激活或共抑制作用，并在腫瘤發生、細胞分化、胚胎發育的調控中發揮重要作用[13]。

綜上所述，基于TCGA 數據庫分析出PLK1 在結直腸癌組織中高表達，其參與細胞增殖、有絲分裂細胞周期的G2/M 轉換等生物過程，通過P53信號通路發揮作用，有望成為診斷結直腸癌的腫瘤標志物。