FoxO1蛋白在癌細胞質中的差異表達及其功能研究

陳 潔，耿慧武，王鳳杰，陳姝文，劉曉穎，范曉云

叉形頭轉錄因子O亞型1(forkhead-box O class 1, FoxO1)是叉形頭轉錄因子O(forkhead-box class O, FoxOs)超家族中的一員，哺乳動物FoxOs超家族包含了FoxO1、FoxO3A、FoxO4等4名成員。已知的FoxOs家族成員的功能包括參與細胞增殖、細胞存活、分化、凋亡、氧化應激、代謝、炎癥、衰老及腫瘤抑制等。FoxO1通過轉錄調節(jié)參與糖代謝、脂肪代謝等相關的疾病，此外，已有研究表明，F(xiàn)oxO1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)oxO1在某些種類的腫瘤中表達下調，如乳腺癌、子宮頸癌、腎癌、前列腺癌等。然而，有研究指出了FoxO1在其他一些類型腫瘤中高表達，如膀胱癌。因此，F(xiàn)oxO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮不同作用值得探究。該研究對肺癌和食管癌及其相應的癌旁組織制作成的組織芯片(tissue microarray, TMA)進行免疫組化染色，探究FoxO1在肺癌和食管癌組織中的差異表達、具體亞細胞定位及相關影響因素；進一步在肺癌細胞系A549和食管癌細胞系Eca109中進行FoxO1的siRNA敲低及后續(xù)的克隆形成實驗，初步探索FoxO1在肺癌和食管癌中的功能，了解FoxO1蛋白的亞細胞定位與腫瘤發(fā)生的可能關系。

1 材料與方法

1.1 材料

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病例資料 收集2013—2015年在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經病理確診的非小細胞肺癌組織及對應癌旁組織110例。收集2018—2019年在該院經病理確診的食管癌組織樣本及相應的癌旁組織48例。上述所有患者均未接受放化療或靶向治療。每位患者簽署了知情同意書。肺癌樣本中，鱗癌組織48例，腺癌組織62例。男性74例，女性36例，年齡48～73歲，中位年齡61歲。食管癌樣本全部為鱗癌，男性38例，女性10例，年齡42～82歲，中位年齡66歲。

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主要試劑 胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基購自美國GE公司；胰酶細胞消化液購自上海碧云天生物技術有限公司；FoxO1抗體購自武漢Proteintech公司(18529-1-AP)；Lipofectamine RNAi MAX購自美國Thermo Fischer Scientific公司；細胞總mRNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司；二甲苯(AR)、無水乙醇(AR)和30% HO(AR)購自上海國藥集團；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

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主要儀器 生物安全柜(BSC-2，新加坡ESCO公司)；微量核酸濃度檢測儀(NanoDrop，美國Thermo Fischer公司)；自動組織包埋機(HistoCroe Arcadia H&C，德國徠卡公司)；全自動輪轉切片機(RM2255，德國徠卡公司)；光學顯微鏡(CX21，日本尼康公司)。

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細胞株 肺癌細胞系A549和食管癌細胞系Eca109購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗方法

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細胞培養(yǎng) A549和Eca109復蘇后，分別用含10%血清的DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細胞生長達80%～90%時傳代。

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siRNA knockdown實驗 將細胞用胰酶消化離心后重懸，按合適密度接種至適當?shù)呐囵B(yǎng)板中，次日細胞匯合度約50%。用Opti-MEM分別稀釋siRNA和Lipofectamine RNAi MAX，靜置5 min后，將兩者等體積溫和混勻，靜置20 min后加入培養(yǎng)的細胞中，6 h后更換不含抗生素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉染48 h后收集細胞進行后續(xù)檢測。FoxO1 siRNA序列見表1。

表1 FoxO1 siRNA序列

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Western blot實驗 棄去6孔板中的細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，棄盡殘液，加入50～80 μl細胞裂解液，冰上裂解15 min，轉移裂解液至1.5 ml離心管，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。配制12% SDS-PAGE凝膠，每泳道上樣30 μg總蛋白，電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌后加入一抗置4 ℃冰箱孵育過夜。次日TBST洗滌后加入二抗孵育，再經TBST洗滌后進行ECL顯影。

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qRT

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PCR實驗 棄去12孔板細胞培養(yǎng)液，之后按試劑盒說明書提取細胞總mRNA。微量核酸濃度檢測儀測定mRNA濃度和純度。按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA。PCR反應體積20 μl，反應條件為：95 ℃初始變性3 min、95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，32次循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2法計算FoxO1與內參比值的相對表達量。FoxO1 qRT-PCR引物序列見表2。

表2 FoxO1 qRT-PCR引物序列

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免疫組化 組織芯片置于二甲苯中脫蠟15 min×2次，取出玻片，依次放入無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇和蒸餾水中，每次3 min。采用枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復，微波爐中高火加熱至沸騰開始計時7 min，暫停1 min后繼續(xù)加熱至沸騰5 min，自然冷卻至室溫。將玻片放置濕盒內，PBS清洗后滴加3% HO溶液完全覆蓋整個組織，室溫反應30 min，PBS洗滌3 min×3次，滴加一抗完全覆蓋整個組織，置4 ℃冰箱內孵育過夜。次日恢復至室溫，PBS洗滌3 min×3次，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3 min×3次，顯微鏡下進行DAB染色，蒸餾水終止反應。加入蘇木精染液中染色2 min，1%鹽酸乙醇分化、0.01 mol/L碳酸鋰藍化后烘干，二甲苯透明，滴加中性樹脂封片，固定后顯微鏡下觀察。根據(jù)染色強弱，對染色結果分別評分為0～3分。0分，細胞核和(或)細胞質內無棕色染色；1分，細胞核和(或)細胞質有淡黃色染色；2分，細胞核和(或)細胞質有中等棕色染色；3分，細胞核和(或)細胞質有棕褐色染色。根據(jù)染色腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的比例，分別評分為1～4分。1分，0%<染色細胞占比≤25%；2分，25%<染色細胞占比≤50%；3分，50%<染色細胞占比≤75%；4分，染色細胞占比>75%。綜合評分=染色評分×占比評分。綜合評分>3分為陽性，綜合評分>6分為高表達，3≤綜合評分≤6分為低表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件對該實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ檢驗，相關性分析采用Spearman相關性檢驗。所有實驗數(shù)據(jù)資料均保留小數(shù)點后3位，

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<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FoxO1在肺癌組織細胞質中表達情況

肺癌組織的免疫組織化學結果顯示，在正常呼吸性支氣管上皮細胞和細支氣管上皮細胞中，F(xiàn)oxO1在細胞核和細胞質中都有表達；在腫瘤細胞中，F(xiàn)oxO1主要在細胞質中表達。比較FoxO1在癌組織及對應癌旁組織細胞質中的表達情況，結果顯示，在肺鱗癌組中，癌組織FoxO1表達高于癌旁的有38例，低表達的有10例，占比分別為79.17%和20.83%；癌旁組織中高表達的有12例，低表達的有36例，占比分別為25.00%和75.00%。在肺腺癌組中，癌組織細胞質中FoxO1高表達的有43例，低表達的有19例，占比分別為69.35%和30.65%；癌旁組織細胞質中高表達的有20例，低表達的有42例，占比分別為32.26%和67.74%。χ檢驗比較肺鱗癌組和腺癌組FoxO1細胞質高、低表達占比情況，結果表明兩種類型的腫瘤間差異無統(tǒng)計學意義(χ=1.342，

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=0.247)。見圖1。

圖1 FoxO1在肺鱗癌、肺腺癌及相應癌旁組織中的表達

2.2 FoxO1在肺癌組織細胞質中的表達與臨床各指標間的相關性分析

FoxO1在肺癌組織細胞質中表達的免疫組化評分與臨床各指標間的相關性分析表明，細胞質中FoxO1的表達與性別、年齡、分化程度、侵襲程度、淋巴結轉移以及腫瘤分期差異無統(tǒng)計學意義。見表3、4。

表3 FoxO1在肺癌組織細胞質中表達的免疫組化評分與臨床各指標間的相關性

表4 性別及組織類型對肺癌組織細胞質中FoxO1表達的影響[n(%)]

2.3 FoxO1在食管癌組織中的表達

免疫組化結果顯示，在食管癌癌旁組織中，F(xiàn)oxO1主要表達在基底層和上皮細胞的細胞核中，間質細胞中表達較低或不表達，見圖2；在癌組織中，F(xiàn)oxO1主要表達于腫瘤細胞的細胞質中，細胞核中表達減少或不表達，其表達與正常細胞中的定位有顯著差異。癌旁組織樣本中陽性表達17例，陰性表達31例；癌組織中陽性表達41例，陰性表達7例，癌組織中陽性率高于癌旁組織(χ=15.875，

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<0.01)。癌旁組織樣本中高表達9例，低表達39例；癌組織中高表達28例，低表達20例，癌組織中陽性率高于癌旁組織(χ=25.089，

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<0.01)。

圖2 FoxO1在食管癌癌旁和癌組織中的表達 A：癌旁組織；B：癌組織;原圖 ×40；局部圖 ×400

2.4 FoxO1在食管癌組織細胞質中的表達與臨床各指標間的相關性分析

該實驗對FoxO1在食管癌組織中的免疫組化評分與臨床各指標間的關系進行相關性分析，結果顯示，F(xiàn)oxO1的表達與腫瘤分期相關，差異有統(tǒng)計學意義(

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<0.05)，而與性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒、分化程度、侵襲程度、淋巴結轉移分期以及是否有其他消化系統(tǒng)疾病差異無統(tǒng)計學意義，見表5、6。

表5 FoxO1在食管癌組織中的免疫組化評分與臨床各指標間的相關性

表6 性別及伴有其他消化系統(tǒng)疾病對食管癌FoxO1免疫組化評判的影響[n(%)]

2.5 FoxO1在肺癌細胞系A549和食管癌細胞系Eca109中的表達及定位

為了驗證腫瘤細胞系中FoxO1的表達是否與組織中的表達一致，該實驗選擇常用的肺癌細胞系A549(圖3A～C)和食管癌細胞系Eca109(圖3D～F)中進行FoxO1的內源性免疫熒光實驗，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。顯微圖像顯示，在上述兩種細胞系中，F(xiàn)oxO1在細胞質和細胞核中均呈彌散分布，但細胞質的表達水平顯著高于細胞核(

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<0.01)，結果與組織中的免疫組化結果一致。

圖3 FoxO1在A549和Eca109細胞中的定位 ×400

2.6 FoxO1 siRNA對A549和Eca109細胞中FoxO1的轉錄水平和蛋白表達水平的影響

為了進一步了解FoxO1在腫瘤細胞中的功能，該實驗使用siRNA干擾技術敲低A549和Eca109細胞的FoxO1的表達。Western blot檢測轉染FoxO1 siRNA后A549和Eca109細胞中FoxO1蛋白表達水平(圖4A～D)；提取細胞總mRNA，qRT-PCR檢測轉染FoxO1 siRNA后A549和Eca109細胞中FoxO1 mRNA表達水平(圖4E、F)。結果顯示，在成功轉染siRNA后，細胞內FoxO1的mRNA和蛋白水平的表達均明顯受到抑制(

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<0.01)。

圖4 FoxO1 siRNA knockdown后FoxO1 mRNA和蛋白表達水平檢測

2.7 A549和Eca109細胞系中FoxO1的敲低對細胞增殖的影響

為了探索FoxO1能否影響腫瘤細胞的增殖能力，該實驗在A549細胞系(圖5A)和Eca109細胞系(圖5B)中瞬時轉染FoxO1 siRNA，隨后進行相應的克隆形成實驗。實驗結果顯示，在上述兩種細胞系中，F(xiàn)oxO1敲低組相對于陰性對照組的細胞克隆數(shù)明顯降低(

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<0.01)，提示FoxO1的敲低抑制了腫瘤細胞的增殖。

圖5 A549和Eca109細胞系FoxO1 的siRNA敲低抑制細胞增殖A：A549細胞系；B：Eca109細胞系；1：陰性對照組；2～4：3個siRNA敲低組

3 討論

在早期階段，采用免疫組化實驗研究蛋白分子在組織中的表達時，各樣本組織貼附在多張載玻片上，在DAB顯色操作時，各標本顯色時間不易控制在相同時間，造成最終的組織顯色存在誤差，對染色結果產生較大的影響。近年來，利用組織芯片技術將多個樣本組織貼附在同一張載玻片上制作成組織芯片，隨后進行免疫組化實驗，可有效避免顯色時間差異的弊端，各組織樣本間的差異性得到可靠體現(xiàn)。

該研究利用肺癌和食管癌組織芯片，使用兔FoxO1多克隆抗體檢測肺癌和食管癌組織細胞質中FoxO1的表達情況，根據(jù)染色強弱和陽性細胞率形成綜合評分并與臨床病理多個指標進行相關性分析。該實驗的免疫組化結果顯示，在正常支氣管上皮細胞中，F(xiàn)oxO1在細胞核和細胞質中都有表達；在肺癌細胞中，F(xiàn)oxO1主要在細胞質中表達。在正常食管上皮細胞中，F(xiàn)oxO1主要表達在細胞核內，細胞質中不表達或低表達；在食管癌細胞中，F(xiàn)oxO1主要表達在胞質中。可見，F(xiàn)oxO1在腫瘤細胞中的表達分布發(fā)生了明顯的改變，即在細胞核中表達減少，而更多地發(fā)生了細胞核向細胞質的轉位。通過內源性免疫熒光實驗，可以清晰觀察到，F(xiàn)oxO1在肺癌細胞系A549和食管癌細胞系Eca109細胞核中的表達顯著低于細胞質。在缺乏外界應激刺激因子、存活因子或生長因子時，F(xiàn)oxO1定位在細胞核中并發(fā)揮轉錄因子活性。而在腫瘤細胞中，PI3K/AKT信號通路被組成性激活，隨后AKT磷酸化FoxO1，進而促進FoxO1轉移至細胞質中失去轉錄調節(jié)活性。用PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002和MAPK/ERK信號通路特異性抑制劑UO126分別處理A549細胞，均可導致FoxO1從細胞質向細胞核的轉位，進而能夠抑制細胞增殖。因此，該結果提示，F(xiàn)oxO1在細胞核中發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。隨后進行的siRNA敲低及相應克隆形成實驗表明，細胞質中高表達FoxO1的A549和Eca109細胞中，F(xiàn)oxO1的敲低能夠抑制細胞增殖，結合免疫組化結果即腫瘤組織細胞質中FoxO1普遍高表達，提示腫瘤細胞質中高表達的FoxO1可能發(fā)揮促癌作用。

FoxO1蛋白的表達和活性受到轉錄與翻譯以及翻譯后的乙酰化、磷酸化或泛素化修飾的多重調節(jié)。鑒于FoxO1在細胞內的不同定位、作用及其自身活性調節(jié)的復雜性，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的確切作用機制有待進一步揭示。