調控ABCG2對胃癌細胞遷移的機制研究

于 超，王亦高，楊 天，徐 龍，張 震

ATP結合盒轉運蛋白亞家族G2(ABCG2)是編碼人類腫瘤多藥耐藥的ABC運輸超家族成員之一，ABCG2蛋白最初是在乳腺癌耐藥細胞系中發現的，故又稱為乳腺癌耐藥蛋白，ABCG2自發現以來，一直是研究的熱點，最新研究表明ABCG2蛋白與多種腫瘤包括胃癌的耐藥性相關。研究表明ABCG2的表達上調可以使藥物外排增加導致細胞耐藥。盡管Wang et al研究表明，在多發性骨髓瘤中，PI3K/Akt信號通路可以調控ABCG2活性,但具體機制不明。PI3K/Akt信號通路在促進癌細胞的生長、增殖、遷移等周期方面具有重要作用，也對細胞多藥耐藥產生影響。人類表皮生長因子2(HER2)作為轉錄調控的重要因子，在信號轉導中扮演重要角色，調節細胞的增殖、分化、侵襲和轉移等功能。前期研究表明干擾胃癌細胞HER2表達后,可以增加胃癌對一線化療藥物奧沙利鉑的敏感性，干擾HER2后， PI3K、Akt和ABCG2表達下降。該研究旨在探討是否存在HER2-PI3K/Akt-ABCG2信號通路，調節ABCG2的表達，對胃癌細胞產生影響，進而為下一步對胃癌細胞的耐藥機制的研究提供參考。

1 材料與方法

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1 病例資料

收集該院普外科八病區2018年1月—2019年12月行胃癌根治手術并經免疫組化病理證實HER2陽性及未在術前使用化療藥物的組織樣本84例。從醫院病歷系統檢索臨床資料，回顧性分析，所有患者都經過電話隨訪，均知情同意，且該研究已經通過醫院倫理委員會的許可。

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2 主要試劑

人胃癌細胞株NCI-N87和MKN-7細胞(武漢普諾賽公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)，慢病毒(上海吉瑪公司)，ABCG2抗體(美國Abcam公司)，PV6000免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒(北京中杉金橋公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，PCR逆轉錄試劑盒(大連Takara公司)。

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3 主要儀器

無菌細胞操作臺(蘇州安泰公司)，細胞培養箱、低溫離心機、酶標儀1510(美國Thermo Scientific公司)，低速離心機(湖南湘儀公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，倒置、正置熒光顯微鏡(型號：DM3000B、DM4000，德國Leica公司)，全自動數碼凝膠成像系統(型號：ChemiQ4600，上海歐翔公司)。

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4 方法

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1

免疫組織化學 石蠟包埋標本4 μm連續切片，具體步驟根據試劑盒說明操作。顯微鏡下觀察HER2陽性胃癌組織中ABCG2蛋白表達情況。

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2

細胞培養 NCI-N87和MKN-7細胞用含15%的胎牛血清、100 U/ml青霉素鏈霉素的RPMI 1640培養基于37 ℃、5% CO培養箱中培養。在細胞生長約80%融合度時，進行相關實驗。

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3

慢病毒設計包裝 根據人ABCG2基因編碼序列，遵循設計原則，設計過表達和干擾慢病毒及相關陰性對照。

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4

細胞轉染及免疫熒光測定 選取對數生長期的NCI-N87和MKN-7細胞，胰酶消化，分別種于6孔板中，貼壁后參照慢病毒包裝手冊進行操作，以感染復數(MOI)等于10的指數轉染6孔板中細胞，培養24 h后，加入2 μl終濃度為5 μg/ml的 polybrene篩選1～2周，37 ℃培養，8～12 h根據細胞狀態換液1次。轉染72～96 h后，通過GFP熒光計數法在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的表達強度和時間來確定轉染情況。將轉染成功各組細胞轉移至細胞瓶中繼續培養,得到穩定的細胞。細胞分組為：未處理的細胞組為Cell組；過表達陰性對照組為LV5NC組；過表達組為LV5-homo組；干擾陰性對照組為LV3NC組，3種干擾組為LV3-609組、LV3-1158組、LV3-1988組。

1

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4

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5

RT-PCR檢測ABCG2的表達情況 按試劑盒說明提取轉染后各組細胞的總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA。設計引物序列，將含有擴增序列的cDNA為模板進行PCR反應。反應結束后記錄各組結果，以GAPDH作為內參，比較分析各組ABCG2的表達，見表1。

表1 引物序列

1

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4

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6

Western blot法檢測蛋白表達 上述方法分組處理好的細胞，細胞裂解液冰上裂解轉染好的NCI-N87和MKN-7細胞，細胞刮刮取細胞，提取細胞總蛋白，Bradford蛋白濃度測定。依次選用12%的濃縮膠和分離膠分離蛋白，轉膜，封閉，一抗搖床孵育過夜，TBST清洗，相應二抗搖床孵育2 h，TBST和TBS洗膜，ECL發光顯色對蛋白進行顯色處理，分析結果。

1

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細胞劃痕實驗檢測胃癌細胞遷移能力 通過劃痕實驗來評價ABCG2對細胞遷移的影響。將NCI-N87細胞和MKN-7細胞胰酶消化平鋪于6孔板中，加入完全培養基，培養至80%～90%狀態。用100 μl無菌槍頭在孔板細胞中央劃痕(劃痕呈十字型)，再用PBS洗去懸浮細胞，加入5% FBS完全培養基。劃痕后分別于0、24、48、72 h，在相同位置用倒置顯微鏡拍照，評價細胞遷移速度。

2 結果

2.1 免疫組化檢測胃癌細胞中ABCG2的表達情況

通過對臨床標本免疫組化檢測表明，在HER2陽性的84例病理標本中，ABCG2陽性表達有60例(棕色)，主要在細胞質中表達。

2.2 ABCG2的表達與胃癌臨床病理特征的關系

收集HER2陽性的84例臨床患者的病理結果，經χ檢驗ABCG2表達與患者臨床病理特征的關系，結果顯示，ABCG2陽性與年齡性別不相關，差異無統計學意義；ABCG2在胃癌組織中的差異表達與分化程度、淋巴結轉移數和TNM分期存在相關性，差異有統計學意義，見表2。

表2 ABCG2表達與胃癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2

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3 細胞轉染效率

經熒光顯微鏡觀察慢病毒轉染的NCI-N87細胞(圖1)和MKN-7細胞(圖2)內可見綠色熒光。各組慢病毒轉染后轉染效率均達80%以上，后以嘌呤霉素篩選穩定轉染單克隆細胞系。

圖1 熒光顯微鏡觀察NCI-N87細胞各組轉染效果 ×100A: LV5NC組; B: LV5- homo組; C: LV3NC組; D: LV3- 609組; E: LV3- 1158組; F: LV3- 1988組

圖2 熒光顯微鏡觀察MKN-7細胞各組轉染效果 ×100A: LV5NC組; B: LV5- homo組; C: LV3NC組; D: LV3- 609組; E: LV3- 1158組; F: LV3- 1988組

2.4 RT-PCR檢測穩定細胞株中ABCG2的表達情況

該研究采用RT-PCR實驗觀察慢病毒轉染后的胃癌NCI-N87和MKN-7細胞株中ABCG2 mRNA表達水平變化情況，結果顯示：LV5-homo組ABCG2 mRNA表達水平明顯提高，差異有統計學意義(

F

=64.390、142.812，

P

<0.01)；LV3-609、LV3-1158、LV3-1988干擾組中ABCG2 mRNA表達水平明顯降低，差異有統計學意義(

F

=130.916、58.467，

P

<0.05)，其中LV3-1988干擾效果最明顯(

P

<0.01)，效率最高，見圖3、4。

圖3 NCI-N87細胞轉染后ABCG2 mRNA的表達量

圖4 MKN-7細胞轉染后ABCG2 mRNA的表達量

2.5 Western blot檢測ABCG2蛋白的表達情況

該研究采用Western blot實驗觀察慢病毒轉染后的胃癌NCI-N87和MKN-7細胞株中ABCG2蛋白表達水平變化情況，結果顯示：LV5-homo組中ABCG2蛋白表達明顯增高，差異有統計學意義(

F

=137.137、164.394；

P

<0.01)； LV3-609、LV3-1158、LV3-1988干擾組中ABCG2蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(

F

=122.657、555.982；

P

<0.01)，其中LV3-1988組干擾效率最高，見圖5、6。

圖5 Western blot檢測人胃癌NCI-N87細胞轉染后ABCG2蛋白表達

圖6 Western blot檢測人胃癌MKN-7細胞轉染后ABCG2蛋白表達

2.6 調控ABCG2對HER2-PI3K/Akt信號通路的影響

該研究采用Western blot實驗觀察慢病毒轉染后的胃癌NCI-N87和MKN-7細胞株中的HER2和PI3K/Akt信號通路中關鍵蛋白表達水平的變化情況。結果顯示：LV5-homo組中HER2、PI3K和P-Akt蛋白表達明顯增高，差異有統計學意義(

F

=144.618、351.626、284.821，

P

<0.05)；LV3-1988組中HER2、PI3K和P-Akt蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(

F

=426.022、153.050、339.490，

P

<0.05)，見圖7、8。

圖7 Western blot檢測人胃癌NCI-N87細胞轉染后通路蛋白表達

圖8 Western blot檢測人胃癌MKN-7細胞轉染后通路蛋白表達

2.7 調控ABCG2對細胞遷移能力的影響

該研究經劃痕實驗對慢病毒轉染胃癌細胞株后調控ABCG2表達水平對胃癌細胞的遷移能力的影響，結果顯示：LV5-homo組在培養24、48和72 h后遷移能力明顯增強，與LV5NC組、Cell組和LV3-1988組的差異有統計學意義[

F

=(2

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649

vs

42

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402)、(2

.

938

vs

56.217)、(33.420

vs

29

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886)，

P

<0.05]，表明增強ABCG2基因的表達后，能明顯促進胃癌細胞的遷移，見圖9、10和表3、4。

圖9 ABCG2表達對胃癌NCI-N87細胞遷移的影響 ×100與Cell組、LV5NC組和LV3-1988組比較：*P<0.05、**P<0.01；與Cell組和LV3NC組比較：#P<0.05

圖10 ABCG2表達對胃癌MKN-7細胞遷移的影響 ×100與Cell組、LV5NC組和LV3-1988組比較：*P<0.05；與Cell組、LV3NC組和LV5-homo組比較：△△P<0.01

表3 NCI-N87各組細胞遷移距離的比較

表4 MKN-7各組細胞遷移距離的比較

3 討論

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。根據全國腫瘤登記中心發布的《2015中國腫瘤登記年報》顯示，胃癌發病率與病死率居所有癌癥前三。胃癌的治療方案是以手術為主，結合放化療的綜合治療。許多患者雖然接受了胃癌根治性切除術和規范的術后治療，但仍出現腫瘤耐藥和復發轉移。

ABCG2是一種結合盒式運輸機，其主要通過水解ATP產生運輸功能。典型的ABCG2由兩個高度保守的 ATP 綁定域和兩個跨膜域組成，并能識別多種抗癌藥物，其自身也是生物體內自我保護機制的重要組成部分。有研究表明，在多種類型的細胞中，ABCG2對細胞自噬產生重要作用，在表達ABCG2的細胞中，觀察到更高的自噬率。研究表明通過下調ABCG2基因的表達，有抑制胃癌細胞增殖的作用，同時也存在防止凋亡的作用。

該研究表明在HER2陽性的胃癌細胞中ABCG2高表達，ABCG2與胃癌的分化程度、淋巴結轉移和TNM分期呈正相關。課題組前期發現HER2可以間接調控ABCG2，產生耐藥作用。為了明確ABCG2對胃癌的影響，該研究通過慢病毒轉染胃癌NCI-N87和MKN-7細胞，調控ABCG2以探究對胃癌細胞的影響。通過轉染后PCR和Western blot檢測驗證轉染是成功的，細胞劃痕實驗表明調控ABCG2基因表達后，在ABCG2過表達的胃癌細胞中遷移明顯增快，結果顯示ABCG2參與調控胃癌細胞的遷移活動。另外PI3K/Akt信號通路可以調控ABCG2活性，而干擾HER2后，PI3K、P-Akt和ABCG2表達下降，所以該研究進一步通過Western blot分析HER2和PI3K/Akt通路蛋白表達情況，結果顯示ABCG2與HER2、PI3K、Akt和P-Akt呈現正反饋聯系。綜上所述，ABCG2可能對胃癌細胞遷移、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期等產生重要作用，且通過向上調節PI3K/Akt通路，在HER2陽性的胃癌細胞中產生重要影響，這可能作為胃癌耐藥機制研究的一個新思路。