m6A去甲基酶FTO促進HER2陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗耐藥

紀琳娣，徐婷娟，殷 梧，程 民，吳新春，卞 庚，程聯勝，胡世蓮，沈國棟

乳腺癌高居女性惡性腫瘤發病率的首位，嚴重危害健康。自從曲妥珠單抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)用于人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)陽性乳腺癌治療以來，患者獲益良多；但經臨床廣泛應用顯示約半數HER2陽性乳腺癌病例會出現耐藥現象，導致腫瘤進展或復發。 N6-甲基腺嘌呤(mA)甲基化是一種廣泛發生于哺乳動物RNA的表觀遺傳學修飾方式，脂肪量與肥胖相關基因(FTO)是其中一種mA去甲基酶，參與個體發育及腫瘤發生發展等生理病理進程。該研究旨在探討FTO與HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗治療抵抗的相關性，并探索自主研制的新型抗HER2人源化A21抗體(HuA21)對耐藥性乳腺癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細胞株BT474購自中國科學院細胞庫，曲妥珠單抗購自羅氏旗下Genentech公司；甲氯芬那酸乙酯(MA2)由中國科學院上海藥物研究所楊財廣教授贈送；HuA21購自合肥瀚科邁博生物技術有限公司；胎牛血清(FBS) 購自美國CLARK Bioscience公司；RPMI 1640培養基購自武漢賽維爾公司；CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊公司；Ki67免疫熒光抗體、鼠抗人FTO與METTL3抗體、兔抗人β-actin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG購自美國CST公司；RNA提取試劑盒購自德國Analytik Jena公司；熒光定量PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術公司。

1.2 方法

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曲妥珠單抗耐藥細胞株制備 參考Ding et al方法采用體外間接梯度法誘導耐藥株，當細胞可以在80 μg/ml藥物濃度下穩定生長時認定為曲妥珠單抗耐藥株(BT474/TR)，將其用于后續實驗。

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細胞處理與形態觀察 取對數生長期的BT474細胞，加入10 μg/ml曲妥珠單抗，分別處理0、4、8 d；BT474/TR被10 μg/ml曲妥珠單抗處理8 d，用于后續實驗，分別在熒光顯微鏡下觀察曲妥珠單抗處理前后的細胞形態學變化。

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免疫熒光檢測 藥物處理后的細胞爬片，預冷PBS清洗，經4%多聚甲醛固定、 0.5% TritonX-100室溫通透，封閉、清洗、4 ℃過夜孵育熒光一抗Ki67、PBS清洗、室溫避光孵育熒光二抗、DAPI染核、滴加抗淬滅液后拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對熒光值進行量化分析。

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細胞周期分析 藥物處理后的細胞制備成單細胞懸液，70%乙醇固定細胞形態， 4 ℃過夜。離心去除乙醇，清洗后向每管細胞沉淀加入500 μl配置好的CCAA溶液(含PI染液50 μg/ml與核糖核酸酶100 μg/ml)，室溫避光孵育30 min后使用安捷倫NovoCyte流式細胞儀檢測細胞周期。

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qPCR檢測 提取細胞內總RNA后進行qPCR實驗，采用2的計算方式來表示基因的相對表達量。以GAPDH為內參，內參及目的蛋白引物序列見表1。

表1 qPCR引物名稱與序列

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Western blot實驗 收集細胞沉淀、裂解、離心、取上清液，BCA法進行蛋白定量，水浴鍋內100 ℃煮10 min使蛋白充分變性。繼續進行上樣、跑膠、轉膜、封閉等步驟，以人抗兔β-actin作為一抗內參，分別以人抗鼠的FTO、METTL3作為目的蛋白一抗，4 ℃孵育過夜,室溫孵育二抗1 h后進行化學顯影，應用Imagine J軟件對蛋白條帶進行灰度值測定。

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CCK-8細胞增殖檢測 在96孔板每孔鋪入適量細胞，培養72 h后棄去培養基，每孔加入100 μl新鮮培養基和10 μl CCK-8試劑，450 nm波長測吸光度。

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藥物處理 分別以0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L濃度梯度的MA2預先處理BT474/TR 48 h，更換不含MA2的新鮮培養基繼續培養72 h后進行CCK-8實驗，選取對細胞生長促進作用最強的濃度進行后續實驗。BT474/TR細胞分別分為Control組(對照組)、Tra組(10 μg/ml曲妥珠單抗處理72 h)、HuA21組(10 μg/ml HuA21處理72 h)、MA2+Tra組(40 μmol/L的MA2預處理48 h后10 μg/ml的曲妥珠單抗處理72 h)、MA2+Tra+HuA21組(40 μmol/L的MA2預處理48 h后10 μg/ml的曲妥珠單抗和10 μg/ml HuA21聯合處理72 h)行CCK-8實驗。

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mA甲基化檢測 使用mA甲基化測定試劑盒方法檢測HER2過表達的人乳腺癌細胞株BT474經曲妥珠單抗處理0、2、4 d和自行制備的曲妥珠單抗耐藥株BT474/TR的mA水平。

2 結果

2.1 BT474/TR細胞形態變化、細胞增殖速度比較

比較BT474和BT474/TR細胞的形態變化，如圖1所示，兩種細胞均表現為聚團生長，形態舒展飽滿，邊緣規則。曲妥珠單抗處理后，BT474/TR形態無明顯變化，但BT474細胞數目減少，胞體皺縮漸變成圓形，邊緣不規則，偽足消失。CCK-8實驗提示BT474組與同時間點的BT474+Tra組、BT474/TR組和BT474/TR+Tra組相比細胞增殖速度減慢(

F

=27.21，

P

<0.05)。經曲妥珠單抗處理0、4、8 d的BT474及BT474/TR，細胞增殖相關抗原Ki67表達比例逐漸減少(

F

=40.56，

P

<0.05，圖2)，細胞周期內S期細胞比例依次降低(

F

=135.20，

P

<0.05，圖3)。

圖1 BT474和BT474/TR細胞形態和增殖速度比較 ×40

圖2 免疫熒光檢測細胞增殖因子Ki67變化 ×40

圖3 流式檢測細胞周期變化

2.2 耐藥株BT474/TR去甲基酶FTO表達情況

BT474細胞在接受曲妥珠單抗處理至轉變成曲妥珠單抗耐藥株BT474/TR過程中mRNA的mA甲基化水平逐漸下降(

F

=109.59,

P

<0.05，圖4)。生物信息學方法分析TCGA數據庫顯示，乳腺癌中Her2基因與METTL3、METTL14、METTL16、FTO、YTHDF1、YTHDF2基因表達之間存在相關性(圖5)。qPCR和Western blot結果顯示曲妥珠單抗處理4、8 d的BT474及經曲妥珠單抗處理8 d的BT474/TR相較于對照組，去甲基酶FTO表達量逐漸增加(

F

=71.48、100.36，

P

<0.05)，甲基轉移酶METTL3表達量未見明顯變化(圖6)。

圖4 m6A甲基化測定試劑盒檢測RNA總m6A含量

圖5 HER2與m6A甲基化相關酶表達之間的相關性分析

圖6 qPCR和Western blot實驗檢測FTO和METTL3表達

2.3 MA2和HuA21聯合作用可增強BT474/TR對曲妥珠單抗的敏感性

CCK-8檢測不同濃度的FTO抑制劑MA2預處理對BT474/TR細胞促增殖作用，如圖7所示，10 μmol/L濃度的MA2對BT474/TR細胞增殖作用最強(

F

=72.73，

P

<0.05)。經MA2預處理的BT474/TR對曲妥珠單抗的敏感性增加(

F

=164.90，

P

<0.05)，同時在MA2預處理的基礎上聯合使用曲妥珠單抗和HuA21較單獨使用曲妥珠單抗對耐藥株的抑生長作用更好(

F

=30.72，

P

<0.05)。

圖7 HuA21與MA2減弱BT474/TR細胞對曲妥珠單抗的耐藥性

3 討論

針對人HER2陽性的乳腺癌類型，目前一線治療方案是曲妥珠單抗聯合化療，但是一部分患者在接受曲妥珠單抗治療初期顯示無效或是在治療期內逐漸產生耐藥現象，使HER2陽性乳腺癌的治療遭遇了瓶頸。研究報道HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗的耐藥機制主要有曲妥珠單抗同ErbB2受體的有效結合受阻、EGFR家族受體和IGF-IR等共表達以及PI3K-AKT信號通路的異常活化等方面，但尚無相關藥物進入臨床使用，迫切需要開展新的曲妥珠單抗耐藥機制的研究。

已有研究表明腫瘤細胞處于休眠期或者靜止期會對藥物治療產生抵抗。該研究中表明人乳腺癌HER2陽性細胞BT474在轉變為曲妥珠單抗耐藥株的過程中，細胞形態發生顯著變化，細胞周期停頓在S期，細胞增殖相關因子Ki67表達下降，曲妥珠單抗對腫瘤細胞的增殖抑制作用減弱，提示耐藥株處于一種生長增殖不活躍的休眠狀態，改變耐藥株的這種休眠狀態，恢復對曲妥珠單抗的敏感性是解決BT474/TR耐藥性問題的關鍵。近年來大量的研究證實mA甲基化在腫瘤發生發展與化療耐藥等方面發揮著重要的作用，該研究表明，敏感細胞株BT474在接受曲妥珠單抗處理至轉變成曲妥珠單抗耐藥株BT474/TR過程中，總mRNA的mA甲基化水平逐漸下降，去甲基酶FTO表達量逐漸增加，甲基轉移酶METTL3表達量未見明顯變化。使用去甲基酶FTO抑制劑MA2抑制BT474/TR細胞FTO蛋白活性后，結果顯示耐藥株對曲妥珠單抗的敏感性增加。

HuA21是該課題組自主研制的一種新型抗HER2人源化單克隆抗體，識別的是HER2胞外域的Ⅰ區的識別表位，有別于曲妥珠單抗結合胞外域的Ⅳ區的表位，這就為曲妥珠單抗和HuA21聯合使用增強對腫瘤細胞的殺傷作用提供了結構基礎，在應用FTO抑制劑MA2預處理以增加耐藥株BT474/TR的mA甲基化程度基礎上聯合使用抗HER2抗體HuA21和曲妥珠單抗可加強對腫瘤細胞的殺傷作用。

綜上所述，抑制人乳腺癌HER2陽性耐曲妥珠單抗細胞BT474/TR的去甲基酶FTO活性，增加mA甲基化程度，可改善BT474/TR對曲妥珠單抗的耐藥作用，聯合使用抗HER2抗體HuA21和曲妥珠單抗可加強對腫瘤細胞的殺傷作用。