sigma-1受體對口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲影響的實驗研究

張紅麗，徐小立，戴永錚，應松成，蔣 勇,4

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)患者占所有口腔惡性腫瘤的90%以上，且容易復發和轉移。早期患者的5年生存率約為55%～60%，晚期患者的5年生存率僅為30%～40%。探索并識別新的診斷和治療分子，從而實現OSCC的早發現和早治療，改善預后，仍然是當前OSCC研究的主要任務。研究表明sigma-1受體是一種具有伴侶活性的非阿片類獨立受體，包括sigma-1受體和sigma-2受體2種亞型。sigma-1受體(簡稱Sig1R，又稱σ1受體)分子量約26 ku，含223個氨基酸，其基因定位和蛋白結構較sigma-2受體更清晰，具有更廣泛的特征。研究表明sigma-1受體在結直腸癌、前列腺癌、宮頸癌和乳腺癌等中呈高表達，并參與癌細胞的發生發展。研究表明，sigma-1受體的表達與乳腺癌患者的總生存率降低相關，且sigma-1受體在細胞水平上增強細胞增殖和遷移。在乳腺癌中的研究表明，sigma-1受體的表達增加了電壓門控鈉離子通道亞型Nav1.5的電流密度，提示sigma-1受體可能通過增加Nav1.5活性進而增強細胞侵襲。該研究擬檢測sigma-1受體在OSCC組織和細胞中的表達水平，探討sigma-1受體在OSCC細胞增殖、遷移和侵襲中的作用及sigma-1受體與Nav1.5之間可能的相互作用，為OSCC的治療提供新的診斷和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM 高糖培養基、PBS購自美國Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)購自烏拉圭ExCell公司；胰酶細胞消化液、RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE配膠試劑盒、0.5% Trixton X-100、DAPI、DAB、CCK-8試劑盒、結晶紫均購自上海碧云天生物技術有限公司；sigma-1受體和Nav1.5多克隆抗體購自美國Affinity公司；IgG標記的山羊抗鼠、抗兔二級抗體購自北京中杉金橋公司；FITC標記的熒光二抗購自成都正能生物公司；PVDF 膜購自美國Millipore公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自南京諾唯贊公司；Lipofectamine2000購自美國 Thermo Fisher 公司；Matrigel 膠、Transwell 小室購自美國 Corning公司；人OSCC細胞系(SCC-4、HSC-3、CAL-27和SCC-9)由南京大學醫學院附屬口腔醫院中心實驗室贈送；人OSCC組織及鄰近正常組織取自安徽醫科大學第一附屬醫院口腔科。

1.2 方法

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細胞培養 OSCC細胞系SCC-4、HSC-3、CAL-27和SCC-9在添加了10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液的高糖型DMEM培養基的細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO培養箱中培養。每隔2 d換1次培養基，細胞長至90%左右用胰酶細胞消化液消化傳代。

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免疫組織化學檢測 為了防止破壞組織抗原性，石蠟包埋的組織切片被放置在60 ℃恒溫箱中烘烤2 h，隨后用二甲苯和乙醇進行脫蠟和水化。用3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗后將切片放入裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的容器中，并在微波爐中加熱15 min以促進抗原修復。將冷卻后的切片用山羊血清封閉15 min，然后加入抗sigma-1受體的一抗(1 ∶200)后4 ℃孵育過夜。將切片與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二級抗體(1 ∶1 000)室溫孵育90 min，并用DAB顯色，蘇木精復染。最后用中性樹脂封片后觀察切片，并使用Image J軟件進行分析。

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細胞免疫熒光實驗 將長好細胞的爬片用4%多聚甲醛固定15 min，然后在室溫下用0.5% Trixton X-100室溫通透20 min。隨后，在PBS浸洗后的爬片上滴加正常山羊血清封閉細胞30 min。加入稀釋好的抗sigma-1受體的一抗(1 ∶200)，并在4 ℃孵育過夜，第二天加入FITC標記的熒光二抗(1 ∶200)在濕盒中37 ℃避光孵育2 h。然后用DAPI對細胞核染色5 min后，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

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Western blot實驗 細胞用RIPA裂解液處理以獲得總蛋白裂解物，蛋白質濃度用BCA蛋白質測定試劑盒測定，隨后按比例加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物后-20 ℃保存。樣品用10%(sigma-1 受體)或6%(Nav1.5)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，并轉移到PVDF膜上，然后用5%奶粉室溫封閉2 h。將膜與稀釋好的一抗在4 ℃孵育過夜，隨后用相應的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗孵育90 min。最后，通過化學發光成像系統曝光，蛋白質印跡條帶通過密度分析定量。

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qRT

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PCR實驗 按照制造商的說明，用TRIzol試劑從OSCC細胞中提取總RNA。然后用引物逆轉錄試劑盒進行基因合成，將RNA逆轉錄為cDNA。定量聚合酶鏈反應在20 μl的反應體積中進行擴增，每組3個復孔。反應條件如下：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，擴增40個循環。所有引物均由上海生物工程公司進行設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

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siRNA轉染 根據制造商的說明，使用Lipofectamine2000用Sig1R-siRNA或陰性對照的siRNA-NC轉染CAL-27細胞。轉染6 h后，用添加10%胎牛血清的DMEM培養基代替無血清基礎培養基，然后在轉染后24 h或48 h收集細胞進行下一步實驗。所有siRNAs均由上海吉瑪制藥有限公司合成。相關siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列

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CCK-8檢測細胞增殖 根據制造商的說明，使用CCK-8試劑盒測定細胞增殖情況。對照組和經siRNA轉染后的CAL-27細胞重新接種在96孔板中(每組設5個復孔)并培養至24、48、72 h。在指定的時間加入CCK-8溶液(10 μl /孔)后37 ℃培養2 h，顯色反應后，用酶標儀測定450 nm 處吸光度值(optical density，OD)。

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Transwell實驗 Transwell細胞遷移實驗是將各組細胞血清饑餓過夜，用無血清DMEM培養基重懸細胞后取200 μl接種到Transwell小室的上室中，然后在下室中加入600 μl含有20% FBS作為化學引誘劑的DMEM培養基。在37 ℃孵育24 h后(侵襲48 h)，用棉簽輕輕擦去上室中剩余的細胞，然后將黏附在過濾器下表面的細胞用4%多聚甲醛固定20 min,并用結晶紫染色30 min。在倒置顯微鏡下觀察被侵入或遷移的細胞圖像，并進行拍照和計數。Transwell侵襲實驗除需要在細胞接種前在上室中預先涂好基質凝膠外，其余方法與遷移實驗一致。

圖1 免疫組化法檢測sigma-1受體的表達

2 結果

2.1 sigma-1受體在人OSCC組織中的表達情況

免疫組化檢測臨床收集的OSCC組織及鄰近正常組織中sigma-1受體的表達。結果顯示OSCC組織中可見明顯的棕黃色染色，表明sigma-1受體呈陽性表達；相反，在正常組織中幾乎看不到棕黃染色，見圖1。結果表明，與正常組織比較，sigma-1受體在OSCC中呈高表達(

P

<0.05)。

2.2 sigma-1受體的表達水平與OSCC患者預后的相關性

利用GEPIA數據庫分析sigma-1受體表達水平與OSCC患者預后的相關性。結果表明，sigma-1受體的表達水平與OSCC患者的總體生存率呈負相關，即sigma-1受體表達水平高的患者的總體生存率低于表達水平較低者，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見圖2。提示sigma-1受體的高表達可能影響OSCC患者的生存和預后。

圖2 sigma-1受體表達水平與OSCC患者總生存率的相關性

2.3 sigma-1受體在OSCC細胞系中的表達情況及定位

Western blot檢測了sigma-1受體在4種OSCC細胞系中的表達水平，包括SCC- 4、HSC-3、CAL-27和SCC-9。結果表明sigma-1受體在4種人OSCC細胞系中均有表達，且在CAL-27細胞中sigma-1受體的表達水平高于其他細胞，見圖3A，因此，選擇CAL-27細胞用于之后的研究。此外，還通過細胞免疫熒光分析檢測sigma-1受體在OSCC細胞中的表達定位，激光共聚焦結果顯示sigma-1受體在CAL-27細胞中主要表達在質膜上，見圖3B。

圖3 sigma-1受體在OSCC細胞中的表達及定位

2.4 Sig1R-siRNA對CAL-27細胞中sigma-1受體表達水平的抑制作用

為了檢測Sig1R-siRNA在CAL-27細胞中的沉默效果，分別通過qRT -PCR和Western blot檢測了sigma-1受體在Control組、siRNA-NC組以及3種Sig1R-siRNA中的mRNA和蛋白質表達水平。與Control組比較，Sig1R-siRNA 1組、Sig1R-siRNA 2組和Sig1R-siRNA 3組sigma-1受體的mRNA表達均明顯下調。sigma-1受體的蛋白表達水平僅被Sig1R-siRNA 2和Sig1R-siRNA 3有效下調，差異有統計學意義(

P

<0.01)。與之相反，Control 組和 siRNA-NC組之間差異無統計學意義，見圖4。這些數據表明Sig1R-siRNA能有效地抑制CAL-27細胞中sigma-1受體的表達水平，接下來的實驗均采用Sig1R-siRNA 3 轉染。

圖4 經 siRNA轉染后 sigma-1受體的表達水平

2.5 下調sigma-1受體表達對CAL-27細胞增殖、遷移和侵襲的影響

通過CCK-8和Transwell分析探究了sigma-1受體在OSCC細胞CAL-27發展中的作用。分別在轉染24、48、72 h后檢測細胞OD值，CCK-8測定結果顯示，與Control組和NC組相比，轉染24 h后，Sig1R-siRNA3組的細胞增殖能力顯著降低(

F

=3.04，

P

<0.05)。見圖5A。通過Transwell試驗檢測了下調sigma-1受體表達對CAL-27細胞遷移和侵襲能力的影響。與Control組和NC組比較，Sig1R-siRNA3組明顯抑制CAL-27細胞的遷移和侵襲(

F

=0.145、0.009，

P

<0.01)。Control 組和 siRNA-NC組之間差異無統計學意義，見圖5B、C。研究證明下調sigma-1受體可以顯著抑制CAL-27細胞的增殖、遷移和侵襲。

圖5 經 siRNA轉染后對CAL-27細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.6 沉默sigma-1受體表達對CAL-27細胞中Nav1.5表達的影響

分別采用qRT-PCR和Western blot檢測了轉染Sig1R-siRNA 3后CAL-27細胞中Nav1.5的mRNA和蛋白質表達水平。結果表明，與Control組和NC組相比，Sig1R-siRNA 3組沉默sigma-1受體表達后細胞內Nav1.5的mRNA和蛋白質表達水平也明顯降低(

F

=1.28，

P

<0.05)。見圖6。結果表明sigma-1受體可能通過與Nav1.5的相互作用從而影響OSCC生物學行為的改變。

圖6 沉默sigma-1受體表達后CAL-27細胞內Nav1.5的表達水平

3 討論

sigma受體最初被誤認為是阿片受體亞型，隨后研究表明其是一種獨特的藥理學調控的伴侶或支架蛋白，獨立于任何其他已知的受體。sigma-1受體最初主要在中樞神經系統進行研究，臨床研究表明sigma-1受體與許多疾病相關，如抑郁癥、神經退行性疾病和藥物成癮等。研究表明，sigma-1受體在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和惡性黑色素瘤等多種人類癌細胞和組織中表達上調，sigma-1受體通過介導脂質筏重構影響乳腺癌細胞系的黏附和增殖。研究表明，siRNA沉默sigma-1受體以及sigma-1受體配體藥物可以抑制乳腺癌、結腸癌和前列腺癌細胞的增殖和遷移。因此，sigma-1受體作為癌癥潛在的新治療靶點和預后標志物，具有重要的研究價值。該研究表明sigma-1受體在OSCC組織和細胞系中高表達，通過轉染siRNA下調sigma-1受體表達顯著抑制了OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲行為，表明sigma-1受體可作為OSCC治療靶點和預后生物標志物的可能性，為OSCC的治療提供了新的方向。

研究表明Nav1.5參與OSCC的發生發展，在乳腺癌中的研究表明sigma-1受體通過與Nav1.5通道的功能性相互作用增加了乳腺癌細胞的侵襲和黏附能力，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中sigma-1受體以4倍對稱性結合Nav1.5通道，增加Nav1.5電流密度，使細胞侵襲能力增強。在MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞中，sigma-1受體通過與幼稚型Nav1.5通道的功能作用增加了細胞對底物的黏附。電壓門控鈉離子通道(VGSCs)已被證明在多種癌癥組織和細胞中異常表達，并與腫瘤的惡性表型和侵襲轉移明確相關。課題組前期研究表明，低分化OSCC組織中Nav1.5的表達水平高于高分化OSCC組織，其表達水平與NLR、PLR、TNM分期及淋巴結轉移密切相關，通過轉染特異性siRNA沉默Nav1.5基因可顯著抑制OSCC細胞的生物學行為。該研究表明轉染Sig1R-siRNA沉默sigma-1受體表達后，CAL-27細胞中Nav1.5的表達水平也隨之降低。因此，研究OSCC中sigma-1受體與Nav1.5可能的相互作用機制及其配體藥物對癌細胞功能的影響具有重要意義和價值。該研究通過細胞免疫熒光實驗表明sigma-1受體可以分布在整個細胞質中，在靠近核周區有聚集分布，可能是在線粒體相關的內質網膜上，這與之前文獻中的研究結果是一致的。綜上所述，該研究表明sigma-1受體參與OSCC的發生發展，并為OSCC的診斷和治療提供了新的思路。