WDR12對GC-1細胞增殖凋亡及核糖體蛋白基因表達的影響

郭 蘭，華 娟

據報道，全球約15%的夫婦患有不孕不育，其中男性因素約占30%～55%。精子發生是一系列基因參與的復雜生物學過程。該課題組前期研究表明，WDR12基因突變與1例近親婚配家系錐形頭部畸形精子癥的男性患者有關。WDR12 是WD重復蛋白家族的成員，內源性WDR12 在細胞的多個生物學過程中發揮作用，例如細胞分裂和增殖、細胞周期調控和核糖體生物發生。核糖體是細胞內合成蛋白質的重要細胞器，目前，已經有研究報道核糖體在精子發生過程中發揮重要作用。該研究利用shWDR12敲低小鼠精原細胞GC-1中WDR12的表達，觀察WDR12對精原細胞增殖、凋亡及核糖體相關蛋白基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

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細胞株 小鼠精原細胞GC-1受贈于安徽醫科大學組胚教研室。

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Q

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PCR引物序列 應用于Q-PCR的相關引物序列(上游序列以F表示，下游序列以R表示)，見表1。

表1 Q-PCR引物序列

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試劑與抗體 DMEM高糖培養液(C11995500BT)購自美國Gibco公司，胎牛血清(04-001-1A)購自以色列BI公司，青霉素和鏈霉素(ST488)、吐溫-20(ST825)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(P0015)、預染蛋白質分子量標準(P0078)、麗春紅染色液(P0022)均購自上海碧云天生物技術有限公司，胰酶細胞消化液(BL512A)、Puromycin(BS080A)、CCK-8試劑盒(BS350B)均購自上海橋星貿易有限公司(Biosharp)，TRIzol試劑(15596026)、Lipofectamine 3000轉染試劑(L3000015)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，RIPA組織/細胞裂解液(R0020)、PMSF(P8340)均購自北京Solarbio公司，異丙醇(80109218)、甲醇(10014118)、甲醛(10010018)、無水乙醇(13015069)、三氯甲烷(10006818)、二甲苯(10023418)等購自中國醫藥集團有限公司，TUNEL試劑盒(A112)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，逆轉錄試劑盒(E047-01A)、SYBR Green qPCR SuperMix試劑盒(E168-01B)購自北京安諾倫生物科技有限公司(novoprotein)。shWDR12質粒購自上海吉凱基因公司。WDR12多克隆抗體(PA5-57635)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。β-actin抗體(AF7018)和山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(S0001)購自美國Affity公司。

1.2 方法

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細胞培養 GC-1細胞培養條件為：10%胎牛血清(FBS)+ 1%青霉素-鏈霉素雙抗+ 高糖DMEM培養基，日常培養在恒溫37 ℃、5% CO濃度的細胞培養箱中。

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細胞轉染 轉染前1 d將5×10～5×10個GC-1細胞均勻接種到6孔板中，使細胞密度在轉染時達到60%～80%。轉染前30 min取出細胞孔板，用37 ℃預熱的PBS洗2遍，加入2 ml無血清的DMEM 饑餓；EP管1：125 μl DMEM+3.75 μl Lipofectamine 3000,指腹輕彈混勻；EP管2：125 μl DMEM+2.5 μg DNA+5 μl P3000，指腹輕彈混勻；各自靜置5min，將管1的體系完全加入管2內混勻后室溫靜置15～20 min，多位置輕輕滴加到饑餓的細胞中，在桌面上交叉晃動孔板使轉染液均勻分布；轉染6 h后更換為完全DMEM培養基，48 h后開始添加已經確定好的嘌呤霉素濃度(1 μg/ml)進行篩選，4～6 d后收取細胞進行相關檢測。將穩定轉染的干擾組和對照組GC-1細胞分別命名為shWDR12組和NC組。

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蛋白提取與Western blot實驗 6孔板每孔加入160 μl新鮮配制的蛋白裂解液(1 ml RIPA裂解液+10 μl PMSF)，冰上充分裂解30 min。按比例加入40 μl 5×蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min，分裝放于-20 ℃冰箱保存。按說明書配制SDS-PAGE凝膠(下層12%的分離膠，上層5%的濃縮膠)，上樣完成后，先80 V恒壓電泳40 min，再120 V恒壓1.5 h；轉膜到硝酸纖維素膜(NC膜)上進行電轉(冰上150 mA恒流轉膜2.5 h)；5%脫脂奶粉封閉1 h后TBST洗3次；NC膜于濕盒中室溫孵育一抗(WDR12與β-actin均1 ∶1 000稀釋)1 h后4 ℃過夜，TBST洗3次；濕盒中二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后洗3次；化學發光成像設備進行顯影后保存圖片。

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RNA提取、逆轉錄及Q

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PCR實驗 RNA提取：6孔板每孔加入1 ml TRIzol試劑，冰上放置5 min后轉移到無酶EP管內，每管加入200 μl三氯甲烷(TRIzol ∶三氯甲烷=5 ∶1)，劇烈混勻15 s；冰上靜置 2～3 min，4 ℃ 、12 000 r/min離心15 min；將上層無色透明水相轉移至新的無酶EP管；加入500 μl異丙醇(與吸出的上層水相等量)，顛倒混勻，冰上靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，底部出現白色沉淀，棄上清液；每管加1 ml 75%乙醇(用預冷的DEPC水提前配制)，輕輕旋轉顛倒管壁進行洗滌，緩慢倒掉洗液；重復洗滌1次；4 ℃、9 000 r/min 再次離心5 min；將離心管倒扣在濾紙上30 min，開蓋使管壁內的乙醇充分揮發；加入20～50 μl DEPC水充分混勻后使用RNA濃度測量儀Nano-Drop檢測并調整RNA濃度(加DEPC水使終濃度為500 ng/μl)，-20 ℃保存。

逆轉錄反應：① 去基因組DNA反應：模板RNA 2 μl，gDNA purge 1 μl，無酶水7 μl；總體積10 μl，42 ℃孵育5 min，結束后立即插入碎冰中；② 逆轉錄反應：上一步得到的的反應體系10 μl，2× cDNA SuperMix 10 μl，輕輕混勻，點動離心，50 ℃、15 min；③終止反應：75 ℃、5 min，-20 ℃冰箱保存。

Q-PCR：先將引物加入ddHO溶解使終濃度為10 μmol/L，然后按說明書配制體系。2× SYBR Q-PCR SuperMix Plus：10 μl，10 μmol/L Primer F：1 μl，10 μmol/L Primer R：1 μl，模板cDNA(10 ng/μl)：1 μl，RNase-free water：7 μl。95 ℃、1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，40個循環；β-actin作為內參，采用相對定量的2計算方法分析目的基因表達的拷貝數倍增變化情況。

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CCK-8檢測細胞增殖 轉染及藥篩后的細胞按照每孔2 000個接種到96孔板，48 h后每孔加入10 μl CCK-8，2 h后用酶聯免疫檢測儀上機檢測GC-1細胞在450 nm處的吸光度值，重復3次以上實驗。

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TUNEL-DAPI雙染色 轉染及藥篩后的細胞在24孔板內進行細胞爬片，長滿至70%～90%時拿出進行實驗：阻水筆固定爬片，1×PBS洗2遍；加50～100 μl 4%多聚甲醛，4 ℃放置25 min進行細胞固定后浸于0.2% TritonX-100溶液中，室溫孵育5 min進行通透處理；1×PBS洗2～3次；加入100 μl 1×Equilibration Buffer全部覆蓋待檢樣本區域，室溫平衡10～30 min；平衡結束后，每個樣本滴加新鮮配制的50 μl TdT孵育緩沖液(34 μl ddHO，10 μl 5×Equilibration Buffer，5 μl BrightGreen Labeling Mix，1 μl Recombinant TdT Enzyme)；封口膜蓋于樣本上均勻分布試劑，濕盒內37 ℃孵育60 min；1×PBS洗2次；然后用1×PBS新鮮配制2 μg/ml的DAPI溶液在黑暗中對樣本進行復染，室溫放置5 min；1×PBS清洗3次；樣本區域加入抗淬滅劑，濕潤封片；熒光顯微鏡下分析樣本，在不同波長處觀察綠色(TUNEL)和藍色熒光(DAPI)，拍照保存。

2 結果

2.1 GC-1細胞轉染后WDR12的表達水平

與陰性對照組(NC組)相比，轉染shWDR12后GC-1細胞中WDR12蛋白的表達水平明顯降低(

t

=22.83，

P

<0.01)，見圖1A。Q-PCR結果同樣顯示細胞內WDR12的mRNA表達水平降低(

t

=4.94，

P

<0.01)，見圖1B。

圖1 GC-1細胞轉染shWDR12后內源性WDR12的表達情況

2.2 GC-1細胞轉染shWDR12后對細胞增殖的影響

對轉染及藥篩后的細胞加入CCK-8，2 h后用酶聯免疫檢測儀檢測細胞在450 nm處的吸光度變化情況，以此反映細胞的增殖速率，經統計顯示WDR12敲低的細胞增殖能力低于NC組的細胞增值能力，差異有統計學意義(

t

=21.77，

P

<0.01)，見圖2。

圖2 GC-1細胞轉染shWDR12后細胞的增殖情況與陰性對照組比較：**P<0.01

2.3 GC-1細胞轉染shWDR12后對細胞凋亡的影響

用TUNEL-DAPI雙染色檢測NC組和shWDR12組細胞的凋亡情況，DAPI標記細胞核，TUNEL標記凋亡細胞，Merge為兩種染色疊加后的效果，熒光顯微鏡下可以看到，shWDR12組的凋亡細胞數量較NC組多(圖3)。

圖3 GC-1細胞轉染shWDR12后細胞的凋亡情況 ×200

2.4 GC-1細胞轉染shWDR12后對核糖體蛋白基因的影響

利用Q-PCR分析了敲低WDR12后核糖體蛋白基因的表達情況，結果顯示RPS3(

t

=31.35，

P

<0.05)、RPL11(

t

=21.47，

P

<0.01)、RPS15(

t

=16.03，

P

<0.05)的mRNA表達量下降，差異有統計學意義，而RPL31(

t

=2.3，

P

>0.05)的mRNA水平與NC組相比差異無統計學意義，見圖4。

圖4 GC-1細胞轉染shWDR12后細胞內的核糖體蛋白基因表達情況與陰性對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

在哺乳動物中，WDR12與核糖體生物發生因子1(Pes1)和增殖阻斷蛋白1(Bop1)共同組成1個名為PeBoW的穩定復合物，該復合物對于哺乳動物細胞的增殖和大核糖體亞單位的成熟至關重要。作為PeBoW的成員，WDR12在32S前體rRNA加工、細胞周期進程、細胞凋亡和細胞增殖中發揮著關鍵作用，而其中最重要的是對于核糖體生物發生的影響。研究顯示WDR12是32S前體核糖體RNA加工和細胞增殖的必需因子，WDR12的N端或C端截短可以阻止32S前rRNA加工為成熟的28S rRNA，并觸發依賴于p53的細胞周期阻滯，從而使細胞正常功能的發揮出現損害甚至缺失。

該研究前期通過對1名來自近親家族的不育男性病例及相關家系進行分析，鑒定了一個WDR12基因的純合錯義突變(p.Ser162Ala/c.484T>G)，經研究表明該突變是導致患者出現重度畸形精子癥的重要原因。WDR12在睪丸組織中高表達，為了進一步了解WDR12在精子發生過程中的作用，該研究使用脂質體轉染方法對來自小鼠的精原細胞系GC-1細胞進行了WDR12的敲低，根據細胞的一些行為學差異表現來探究WDR12的功能。研究結果表明轉染shWDR12后細胞的內源性WDR12表達水平顯著降低。進一步的生物學分析顯示，轉染shWDR12后GC-1細胞的增殖能力減弱，這與前期的研究結果一致。同時在敲低WDR12的小鼠精原細胞中觀察到RPS3、RPL11和RPS15這3個核糖體蛋白基因的表達量下降，核糖體是催化蛋白質合成的細胞器，由1個小的40S亞基和1個大的60S亞基組成，RPS3、RPS15編碼的核糖體蛋白是40S亞基的1個組成部分，RPL11編碼的核糖體蛋白是60S亞基的組成部分，提示了WDR12可能是通過降低核糖體亞基生成的途徑影響核糖體的生物發生過程，但其具體機制還有待進一步研究。

已有研究報道核糖體功能與男性不育之間息息相關。如Zhang et al系統地分析了畸形精子癥患者的基因表達譜，并發現了畸形精子癥患者中下調的基因。其中一些下調的基因就是核糖體蛋白基因，如核糖體蛋白S3(RPS3)、RPS5、RPS6、RPS16和RPS23。Rpl10l是小鼠生精細胞中的一種核糖體成分，參與核糖體的組裝。Rpl10l缺陷的雄性小鼠精子發生障礙并且完全不育，具體表現為絕大多數精母細胞發育停滯在減數第一次分裂前期向中期的轉換，沒有減數分裂后的生殖細胞產生。且Rpl10l缺失后粗線期及雙線期精母細胞中的核糖體生成減弱并且大量蛋白的含量發生變化。此外，利用全外顯子測序(WES)的方法在3例男性不育患者中發現了Rpl10l突變。WDR12是核糖體生物發生所必需的關鍵蛋白，目前對WDR12功能的相關研究主要集中在心肌細胞和腫瘤細胞中，而在男性不育患者中未見相關WDR12基因功能的研究。該研究通過干擾GC-1細胞中WDR12的表達，觀察WDR12對GC-1增殖、凋亡以及核糖體蛋白基因表達的影響，進一步揭示了WDR12在精子發生過程中的可能作用，為臨床上鑒定不育男性的致病基因提供了新的參考。