microRNA-200a抑制肝細胞癌的進展及調控索拉非尼治療效果的研究

魏 昇，周大臣，方 超，楊茗皓，趙慧詠，龐小溪，崔 笑

原發性肝癌在全球惡性腫瘤中發病率位居第6位，病死率第4位。進展期肝癌的一線臨床常用治療藥物為索拉非尼。肝癌患者使用索拉非尼后常出現耐藥現象。如何改善此現象成為該研究的切入點。微小核糖核酸(microRNA)是一類分子量 20～25 個堿基的小分子非編碼 RNA。microRNA常與目的基因mRNA 3′端通過堿基互補配對原則不完全互補結合，進而調控目的基因。miR200a 是 miR200 家族的一員,因其在腫瘤進展和轉移的重要性而備受關注。研究表明miR200 家族成員在癌癥中的主要作用被認定為腫瘤抑制因子。前期實驗中已驗證miR200a可抑制人肝細胞癌上皮間質轉化(結果未發表)。

SIRT1是哺乳動物sirtuin家族(SIRT1-SIRT7)的成員之一，是一種NAD依賴性組蛋白去乙酰化酶，其在機體各種生命活動過程中起著非常重要的作用。SIRT1的過表達顯著上調血管內皮生長因子受體，促進腫瘤新生血管的形成，增強了遷移和侵襲能力，這與索拉非尼抗腫瘤機制相關。并有研究報道SIRT1的過表達是導致索拉非尼耐藥現象發生的重要原因。

1 材料與方法

1.1 材料

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細胞株 人肝癌Huh-7細胞株來自中國科學院細胞庫。

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實驗動物 18只雄性BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，體質量18～22 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCKK(蘇)2018-0008。

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試劑與儀器 DMEM高糖細胞培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國 Gibco 公司，BCA試劑盒、4%多聚甲醛、MTT、青鏈霉素、結晶紫均購自北京碧云天生物技術有限公司，β-actin和SIRT1購自美國Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔/鼠IgG二抗購自北京中杉金橋有限公司，二甲雙胍和索拉非尼購自上海MCE公司。細胞培養箱購自美國Thermo Fisher公司，熒光倒置顯微鏡購自日本O-LYMPUS公司，酶標儀購自上海科華生物工程股份有限公司。

1.2 方法

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細胞培養 將人肝癌細胞構建miR200a穩轉細胞株：miR200a過表達組、Control組、miR200a敲低組，10%胎牛血清+1%雙抗的高糖培養基中培養，細胞培養箱培養條件為：37 ℃、5% CO。每2～3 d更換培養液，細胞數為70%～90%時，0.25%胰酶消化，傳代(不超過10代)。

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分組與處理 將處于對數生長期轉染細胞常規接種于96孔板(2.5×10個/孔,100 μl/孔)或6孔板(3×10個/孔，2 ml/孔)，每組細胞加入終濃度為10 μmol/L索拉非尼處理24、48、72 h。

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細胞活力的測定 將轉染細胞接種于96孔板內，每孔2 500個，處理結束后每組取5孔，加入5 mg/ml MTT 溶液10 μl,37 ℃孵育4 h后加入150 μl異丙醇室溫振蕩10 min，酶標儀于波長570 nm和630 nm處測定吸光度(OD)值，用570 nm處OD值光度-630 nm處OD值反映細胞活力。

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Western blot法檢測SIRT1的表達 轉染細胞PBS洗2遍，加入蛋白裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑比例為1 ∶100 ∶100)，待細胞裂解完全后吸取懸液在4 ℃離心機離心并吸取蛋白上清液，儲存于-80 ℃冰箱，用BCA法測蛋白濃度并進行蛋白質定量，加上樣緩沖液煮沸10 min變性，以蛋白質30 μg進行 SDS-PACE電泳。轉膜后，用含5% BSA的TBST室溫慢搖封閉1.5 h，分別加入β-actin和SIRT1抗體，4 ℃孵育過夜，加入相應的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠/兔抗體孵育1 h，洗膜后用顯影儀檢測蛋白顯影。

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Transwell 實驗檢測細胞遷移侵襲能力 無血清DMEM培養基饑餓處理目標細胞6 h，遷移、侵襲重懸細胞懸液細胞數分別為2×10和1×10個。下室中加入含30%胎牛血清的DMEM培養基600 μl，上室中加入150 μl經過不同處理的細胞懸液，放入孵箱中孵育48 h，每組設2個復孔。取出小室，純水洗滌，4%多聚甲醛固定25 min以上，加入0.1%結晶紫水溶液染色20 min，純水洗凈。用棉簽擦凈上室里存留的液體和細胞，在倒置顯微鏡下拍照且計數，隨機選擇不同的視野進行統計學分析。

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動物分組及處理 SPF級BALB/c-nu雄鼠18只，飼養于恒溫恒濕、12 h/12 h晝夜交替的環境中，自由攝取水和食物。采用隨機數表法將裸鼠分為3組(

n

=6)，每組皮下種植miR200a過表達組、Control組、miR200a敲低組細胞(1×10個/只)皮下種植于裸鼠右側腋窩下。待瘤體達50 mm時，開始注射索拉非尼，每次注射前記錄裸鼠的體質量和瘤體的大小。注射藥物14 d后處死裸鼠，取出瘤體記錄相應的體積。

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RNA提取 取出轉染細胞PBS清洗2次，加入TRIzol 1 ml(全程冰上操作)10 min，吹勻，將各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入三氯甲烷200 μl/管，上下顛倒振搖混勻。冰上靜置，低溫離心。離心后小心吸取最上層無色液體移入一新的無酶EP管中。加入異丙醇混勻，冰上靜置，離心，去上清液，加入無酶水稀釋75%乙醇，混勻，離心。棄上清液，干燥沉淀。加入適量無酶水，測取總RNA濃度及純度，并用瓊脂糖凝膠電泳驗證質量，-80 ℃保存。

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qRT

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PCR法檢測 將提取總RNA按10 μl反應體系進行逆轉錄：PrimeScriptRT Master MIX 2 μl，總RNA量1 000 ng，加無酶水至10 μl，根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。最后以cDNA為模板使用對應引物進行目的基因的擴增，反應體系為10 μl，cDNA 1.6 μl，特異性引物3.2 μl，SYBR 5.2 μl。以GAPDH作為內參。miRNA逆轉錄及目的基因擴增按相關試劑盒操作。

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免疫組化法檢測 將裸鼠腫瘤冰凍切片用純水沖洗2次，每次5 min，10%過氧化氫去離子水 ∶甲醇(1 ∶9)孵育10 min，以滅活內源性過氧化物酶活性，TBST沖洗3次，每次5 min，破膜液(濃度0.25% Triton X-100的TBS)10 min，TBST沖洗，滴加10%山羊血清封閉液，室溫孵育2 h，油性筆畫圈，滴加一抗，4 ℃過夜。回收一抗，TBST沖洗，滴加反應增強液，清洗滴加相應辣根過氧化物酶標記的二抗，純水沖洗，DAB顯色后自來水沖洗終止反應，蘇木精染核20 s，純水沖洗。梯度脫水、固定、中性樹膠封片后鏡下觀察。

2 結果

2.1 轉染細胞系qRT-PCR驗證miR200a表達量及miR200a對肝癌細胞的活力的影響

miR200a過表達組miR200a表達量最高、Control組居中、miR200a敲低組最低(

F

=33.05,

P

=0.000 6)。miR200a抑制肝癌細胞的活力，MTT法檢測miR200a轉染處理后細胞活性的變化。miR200a過表達細胞活力低于Control組，miR200a敲低組細胞活力高于Control組(

F

=249.6,

P

<0.001)，差異均有統計學意義(圖1)。

圖1 miR200a對肝癌細胞的活力的影響A：qRT-PCR 檢測轉染細胞系miR200a表達量；B：MTT 檢測miR200a對肝癌細胞活力的影響；與對照組比較:*P<0.05

2.2 miR200a對肝癌的遷移侵襲能力的影響

Transwell 小室實驗結果顯示轉染細胞系經小室培養48 h后遷移和侵襲結果:miR200a過表達組穿膜的細胞數明顯少于Control組和miR200a敲低組(

F

=37.58,

P

=0.007 5;

F

=70.43,

P

=0.003 0)。轉染細胞系添加索拉非尼處理后miR200a過表達組、Control組和miR200a下調組穿膜細胞明顯少于相應未加藥處理組(圖2)。

圖2 miR200a對肝癌細胞的遷移、侵襲能力的影響

2.3 miR200a對索拉非尼抑制肝癌細胞的藥效作用的影響

用不同濃度(0、2、4、8、12、16 μmol/L)索拉非尼處理Control組細胞24、48、72 h，且當索拉非尼濃度為12 μmol/L時，Control組細胞IC。因此，該研究選擇12 μmol/L為該實驗的最適濃度。用12 μmol/L處理轉染細胞系48 h，miR200a過表達細胞活力低于Control組，miR200a敲低組細胞活力高于Control組(

F

=157.8,

P

<0.05)(圖3)。

圖3 篩選索拉非尼濃度對肝癌細胞活力的影響

2.4 miR200a對肝癌細胞SIRT1轉錄和翻譯過程的影響

qRT-PCR、Western blot 結果顯示：與Control組比較，MiR200a過表達組SIRT1的表達量明顯降低，miR200a敲低組表達量明顯上升(

F

=78.63，

P

=0.002 6)。加入12 μmol/L索拉非尼后處理48 h，miR200a組SIRT1的表達減低(

F

=16.39.

P

=0.001 9)。miR200a可以下調SIRT1表達，miR200a抑制人肝癌細胞株增殖與遷移，并且可能參與調控SIRT1影響索拉非尼藥效，并在相關網址預測其作用靶點(圖4)。

圖4 miR200a對SIRT1轉錄及翻譯的影響

2.5 miR200a對裸鼠腫瘤進展的影響

在裸鼠皮下成瘤實驗中，miR200a過表達組體積明顯低于Control組和miR200a敲低組且相應瘤體免疫組化圖結果顯示miR200a過表達組Ki67表達明顯少于Control組和miR200a敲低組(圖5)。

圖5 miR200a對Ki67的表達的影響

3 討論

肝細胞肝癌是由多種基因、多種因素調控的惡性疾病，常見的基因作用途徑包括：RAS蛋白-有絲分裂原活化蛋白激酶(RAS-MAPKK)通路、Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK-STAT)通路、Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)通路和磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3k/Akt/mTOR)通路。以索拉非尼為代表的多激酶抑制劑是治療肝癌的一線用藥，延長患者的生存時間，通過以上信號通路抑制肝癌的進展。索拉非尼耐藥導致肝癌進展也是肝癌治療中的棘手問題，研究表明這一機制主要依賴SIRT1調控，SIRT1通過去乙酰化抑制β-catenin表達激活Wnt/β/catenin通路和NAD/SIRT1/AMPK axis通路參與索拉非尼耐藥機制。通過檢索miRbase數據庫預測SIRT1的mRNA 3′端是miR200a-3p結合位點。miR200a在包括乳腺癌、結直腸癌、腎癌、肝癌等多種腫瘤中調控不同靶基因發揮著抑癌作用，該實驗結果顯示上調miR200a可以抑制肝癌細胞的增殖和侵襲行為，下調可以促進肝癌的進展。實驗顯示miR200a不僅抑制SIRT1蛋白表達，而且負性調控其mRNA水平。在體內和體外實驗中，上調肝癌細胞中miR200a水平可以強化索拉非尼的抑癌作用，下調則誘導索拉非尼的耐藥效果。這一研究展現了miR200a作為未來抗肝癌治療臨床應用的潛質。二甲雙胍是2型糖尿病患者的一線用藥，近年來有研究表明二甲雙胍可以抑制肝癌細胞的生長，該實驗使用二甲雙胍可以上調肝癌細胞中miR200a的表達，并可提升索拉非尼的抑癌藥物療效。實驗結果未發表。

綜上所述，miR200a下調SIRT1抑制人肝癌細胞增殖和遷移的能力，在肝癌細胞中上調miR200a可以增加索拉非尼藥物敏感性。在臨床上，大部分肝癌患者的miR200a水平一般多為低表達，這與大部分肝癌患者索拉非尼耐藥相符。未來該課題組將進一步完善miR200a如何增加索拉非尼藥敏性的相關實驗機制，為未來研制新的肝癌靶向藥物治療方案和提高患者遠期生存率提供理論基礎。