光動力療法對牙齦卟啉單胞菌和福賽坦菌生物膜的抗菌效果

陳 晨，何家才

種植體周圍炎是一種發生在種植體周圍組織與牙菌斑相關的病理性疾病，其特征是種植體周圍黏膜發炎，隨后支持骨喪失。有報道稱種植體周圍炎是由革蘭陰性細菌感染所引起的，如牙齦卟啉單胞菌(

Porphyromonas

gingivalis

，

P

gingivalis

)和福賽坦菌(

Tannerellaforsythia

，

T

forsythia

)。機械清創術因其一定的臨床操作風險而慎用，抗生素療法也會導致耐藥菌的產生。目前，尚缺乏種植體周圍炎有效的臨床治療方法。自1999年第1個光動力治療藥物被批準以來，光動力療法( photodynamic therapy ,PDT)由于其侵襲性和重復性極小且無誘導耐藥性而成為一種引人注目的治療方式。光動力治療結合光敏劑和可見光，在氧的存在下產生對細菌有毒的細胞毒性活性氧(reactive oxygen species ,ROS)，如單線態氧。該文旨在研究新型光敏劑NHS-BODIPY-Br在體外對

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和

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生物膜的抗菌作用，以期為種植體周圍炎的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

P

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(ATCC 33277,美國模式培養物集存庫)；

T

forsythia

(ATCC 43037,美國模式培養物集存庫)；光敏劑NHS-BODIPY-Br(中國科學技術大學化學與材料科學學院提供)；胰酶消化液(上海碧云天生物技術有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；阿爾瑪藍試劑盒、顯色基質法鱟試劑盒、PBS緩沖劑(美國Solarbio公司)；活/死染試劑盒、CO恒溫孵箱(美國賽默飛公司)；DMEM培養液(美國Gbico公司)；腦心浸液肉湯、氯化血紅素、脫纖維羊血、0.02%維生素K1(青島海博生物公司)；680 nm半導體激光治療儀(中國遠明激光公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡880(德國zeiss公司)；厭氧培養箱(英國DWS公司)；酶標儀(美國bio-tex公司)。

1.2 方法

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1

光敏劑的準備 將光敏劑NHS-BODIPY-Br在PBS中稀釋成不同濃度：5、10、15 mg/L。制備好的光敏劑在容器中避光以消除反應，并在8 ℃下保存備用。

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2

細胞增殖實驗 從該課題組取SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)進行培養，取P3代進行實驗。將BMSCs以4×10個/ml的密度接種于96孔板中。培養24 h待細胞貼壁后吸出培養液，用PBS清洗，將不同濃度的NHS-BODIPY-Br加入，沒有加光敏劑的細胞作為對照組。分別在培養第1、3、5天將CCK-8以1 ∶9的比例加入DMEM培養液中，將細胞培養板置于37 ℃恒溫培養箱中2 h，隨后在450 nm波長處檢測各孔的吸光度。每組設6個復孔，實驗重復3次。

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3

生物膜的培養 將

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接種在BHI固體培養基上 ,在厭氧培養箱中培養7 d后收獲菌落。用 PBS 稀釋細菌并采用麥氏比濁法配制成細菌懸濁液2.5×10～3.5×10CFU/ml。將0.1 ml的細菌接種在96孔板中，在37 ℃厭氧箱中培養48 h，獲得的生物膜用于阿爾瑪藍和脂多糖實驗。將1 ml同樣密度的細菌接種在共聚焦培養皿上，厭氧培養48 h獲得的生物膜用于激光共聚焦熒光成像。

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光動力治療 去除培養液后，在96孔板中加入0.02 ml不同濃度的光敏劑，在共聚焦培養皿中加入1 ml光敏劑，反應5 min后去除光敏劑，使用680 nm波長，光劑量為150 mw/cm的二極管激光器工作100和200 s，分別對應15和30 J/cm。

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5

阿爾瑪藍活力分析 激光處理結束后，阿爾瑪藍溶液以1 ∶10的比例加至培養液中，96孔板每孔中加入0.1 ml該混合液后在37 ℃培養箱中培養20 min。以600 nm作為參考波長，在570 nm波長下用酶標儀讀取吸光度值。沒有加入光敏劑的細菌作為對照組。吸光度減少率(%)計算如下：(對照組阿爾瑪藍的吸光度-光動力治療后阿爾瑪藍的吸光度)/對照組阿爾瑪藍的吸光度×100%。每組設6個復孔，實驗重復3次。

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脂多糖檢測 在光動力治療后，剩余的脂多糖濃度通過內毒素檢測試劑盒來定量。加入細菌沒有光照的是陽性對照組，沒有加入細菌的是陰性對照組。在545 nm處讀取吸光度的結果。每組設6個復孔，實驗重復3次。

1

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2

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7

共聚焦 光動力治療后，在每個共聚焦培養皿中加入1 ml的活/死染溶液，反應20 min后吸出溶液，用PBS清洗3次后用于共聚焦顯微鏡觀察。對照組未進行激光照射。每個治療組設3個重復皿。圖片使用軟件ZEN進行分析。

2 結果

2.1 NHS-BODIPY-Br濃度對BMSCs細胞增殖的影響

與對照組相比，A、B、C組細胞吸光度值無明顯差異(

F

=1.715、2.112、1.037,

P

>0.05)，差異無統計學意義。見圖1、表1。

圖1 CCK-8檢測不同濃度光敏劑對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響A組:5 mg/L; B組:10 mg/L; C組:15 mg/L

表1 CCK8檢測不同時間和組別的細胞OD值

2.2 NHS-BODIPY-Br濃度和光照時間對細菌活力的影響

不同濃度的NHS-BODIPY-Br經過光照0、100、200 s處理后，阿爾瑪藍檢測結果顯示生物膜的減少率持續上升(

F

=28.882、60.525、36.923，

P

<0.05)。例如，當NHS-BODIPY-Br濃度5 mg/L，光照0 s時細菌減少約17%，光照100 s時細菌減少率約67%，光照200 s時減少率約78%。值得注意的是，當NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L和15 mg/L，光照100 s和光照200 s時細菌的減少率均接近98%，差異無統計學意義。見圖2、表2。

圖2 阿爾瑪藍檢測結果

表2 阿爾瑪藍檢測不同光敏劑濃度和光照時間對細菌生物膜的減少率

2.3 NHS-BODIPY-Br濃度和光照時間對細菌脂多糖水平的影響

不同濃度的NHS-BODIPY-Br經過光照0、100、200 s處理后，脂多糖檢測結果顯示殘余生物膜脂多糖的吸光度值持續下降(

F

=41.095、69.514、17.840，

P

<0.05)。當NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L和15 mg/L，光照100 s和200 s時，殘余的脂多糖水平與陰性對照組相比，差異無統計學意義。見圖3。

圖3 殘余脂多糖水平

2.4 不同NHS-BODIPY-Br濃度和光照時間處理后的共聚焦顯微鏡成像

圖4A顯示的是對照組的死活染。從圖中綠色熒光度可看出對照組細菌存活水平顯著。圖4B、E中紅色熒光和綠色熒光相間，當NHS-BODIPY-Br濃度5 mg/L，光照100 s和200 s時還有存活的細菌。圖4C、D、F、G中紅色熒光度豐富，整個生物膜中沒有活的細菌菌落。

圖4 共聚焦熒光成像 ×20

3 討論

近年來，光動力治療作為種植體周圍炎的輔助治療手段引起了越來越多的關注。與傳統療法相比，PDT有一些優勢。光動力學療法已在醫學上用于腫瘤的治療，并建議將其用于消除齦下微生物從而對根表面進行更好的滅菌。該研究以NHS-BODIPY-Br作為光敏劑，680 nm半導體激光作為光源，評估了PDT對

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和

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生物膜的抗菌作用。該實驗使用的BODITY類光敏劑在光動力治療中展示出其獨特的優越性，其吸收峰值為680 nm波長，化學性質穩定，摩爾消光系數高，暗毒性低，其中溴原子的加入使系間穿梭效率明顯提升，單線態氧量子產率得到明顯改善，達到0.76。紫外線被證明對口腔微生物具有出色的抗菌功效。然而，紫外線的照射可能導致DNA損傷和紫外線引起的皮膚損傷，而可見光和近紅外光被認為是安全的。而且激光可以改變牙本質，從而使膠原纖維暴露，膠原蛋白可促進血凝塊的附著和穩定。所以該文使用的是一種低功率的半導體激光治療儀，大量研究表明只要參數設置合理，使用方法正確，就不會造成牙根和牙周組織的損害。該研究的實驗組與對照組樣品相比，CCK-8的結果并未隨著NHS-BODIPY-Br的加入而降低，表明NHS-BODIPY-Br對細胞無毒性，表明了NHS-BODIPY-Br具有生物相容性。通過阿爾瑪藍來檢測不同光敏劑濃度以及光照時間細菌生物膜的減少率，當NHS-BODIPY-Br濃度越高，光照時間越久，細菌的減少率越高,這與Umeda et al使用光敏劑亞甲基藍的結果一致。脂多糖是革蘭陰性菌如

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的主要細胞壁成分，殘余脂多糖水平的多少可以間接反應殘余的細菌數量。NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L，光強度15 J/cm時脂多糖含量接近陰性對照組的含量，這與細菌活力的結果一致。該研究中共聚焦熒光顯微鏡成像顯示當NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L，光強度15 J/cm時能完全殺滅生物膜中的細菌，光動力治療可以激活敏化細胞產生ROS，從而促進細菌的死亡。目前研究的一個局限是生物膜的厚度相對較低。該研究是雙種群生物膜生長2 d，不能完全代表一個真正口腔環境的復雜性，因此，未來的研究必須考慮生物膜厚度的變化。

革蘭陰性細菌的細胞包膜是一種較為復雜且相對不易滲透的結構，由內質膜和外膜組成，外膜由肽聚糖層隔開，而且由于抗菌藥物難以有效穿透生物膜致其在生物膜內活性較低。因此，選擇PDT作為替代療法很重要。Fontana et al通過激光共聚焦掃描顯微鏡表明，亞甲基藍對生物膜敏感性降低的原因是亞甲基藍穿透生物膜的滲透性降低，導致在生物膜外層滯留，而且吩噻嗪類光敏劑如亞甲基藍、甲苯胺藍O等是細菌多藥耐藥泵的底物。但是該研究中當NHS-BODIPY-Br濃度10 mg/L，光強度15 J/cm時，整個生物膜中的細菌完全被殺死，說明光敏劑NHS-BODIPY-Br在整個生物膜中無處不在。而且光敏劑NHS-BODIPY-Br負載于具有良好水溶性的納米藥物載體中，這可能是它能穿透細菌生物膜的原因。