C-Myc通過調控lncRNA NEAT1對口腔鱗癌細胞增殖作用的研究

許玉俊，朱友明， 何家才，3

口腔惡性腫瘤是世界第6大常見癌癥，近些年其發病率在中國呈上升趨勢。大部分惡性腫瘤細胞即使在氧供充足的情況下，其葡萄糖代謝也傾向于糖酵解，從而發生“有氧糖酵解”現象，即“Warburg效應”。有氧糖酵解不僅能夠為腫瘤細胞提供增殖所需的能量，也能夠為新生的腫瘤細胞提供合成代謝的底物。據報道，C-Myc參與細胞凋亡，而且與多種惡性腫瘤的發生及發展有關。研究表明，長鏈非編碼RNA核富集轉錄本1(long non-coding RNA nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1)在多種惡性腫瘤中的表達水平呈現異常，但是，其表達量上調的機制還未完全清楚。該實驗擬探討C-Myc和lncRNA NEAT1在口腔癌細胞中的調控關系以及lncRNA NEAT1對口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma ，OSCC)細胞糖酵解水平的調節機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取15例安徽醫科大學第一附屬醫院和安徽省口腔醫院頜面外科初診確認為口腔癌的患者的口腔癌組織及正常癌旁組織。所有口腔癌患者術前均未進行過放化療等治療。標本置于凍存管內，編號，液氮中保存待用，記錄相關信息。

1.2 主要材料

OSCC3、人胚胎腎細胞293T、大腸桿菌DH5α(安徽省口腔疾病研究重點實驗室保存)；胎牛血清購自美國康寧生命科學有限公司；噻唑藍(MTT)試劑、RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；TRIzol細胞裂解試劑購自美國賽默飛世爾科技公司；逆轉錄試劑購自日本寶生物工程有限公司。載體質粒 plko.1、pCDH，慢病毒包裝質粒pRev、pGag、pVsvg、pAX2、pMD2，表達載體plko.1-shc-Myc、對照組plko.1-shctrl、flag-c-Myc，對照組flag空載(中國科學技術大學生科院提供)；表達載體plko.1-shlnc-NEAT1(plko.1-shlncNEAT1 AAGTCCAAAAGGAGCACT)及對照組 plko.1-shConctrol(該實驗室構建)；lnc-NEAT1、對照組Control質粒、PCR引物(由上海生工技術服務有限公司設計合成，pCDH-lnc-NEAT1載體的引物，上游引物：GCGAATTCGCAAAAGTTGTGGCAAGTCCAGCC；下游引物：GCGGATCCTACCCACCATTCCCTTCTCCTAGT)(中國科學技術大學生科院實驗室提供)。

1.3 方法

1

.

3

.

1

細胞培養及傳代 OSCC3、293T細胞用10% 胎牛血清以及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養液置37 ℃、5% CO的培養箱中培養，每3 d換1次液；待細胞融合至80%時，消化、傳代，繼續培養。

1

.

3

.

2

構建表達載體plko.1-shlnc-NEAT1、包裝慢病毒和轉染OSCC3細胞 根據shlnc-NEAT1 AAGT CCAAAAGGAGCACT，合成plko.1-shlnc-NEAT1。擴增目的片段，回收。37 ℃水浴酶切目的片段和質粒載體 plko1，連接產物和載體。連接產物轉入感受態的大腸桿菌DH5α體內，涂于Luria-Bertani培養基上，培養箱倒置過夜、篩選、測序鑒定，成功構建plko.1-shlnc-NEAT1。慢病毒包裝:消化293T細胞，6孔板內培養，待細胞融合至50%時，用上述攜帶目的片段的表達載體(2 μg)和病毒包裝質粒(2 μg pRev、2 μg pGag、1 μg pVsvg)共轉染293T細胞，培養48 h后，收集病毒上清液，過濾、分裝、-80 ℃保存。慢病毒轉染：病毒感染前24 h，消化OSCC3細胞，鋪6孔板，待細胞融合為30% 時，上述病毒液感染OSCC3，同時加入2 μl的8×10g/L 聚凝胺，培養24 h、換液，繼續培養。

1

.

3

.

3

構建表達載體pCDH-lnc-NEAT1、包裝慢病毒和轉染OSCC3細胞 由上海生工技術服務有限公司設計pCDH-lnc-NEAT1載體的引物，上游引物： GCGAATTCGCAAAAGTTGTGGCAAGTCCAGCC；下游引物：GCGGATCCTACCCACCATTCCCTTCTCCTAGT，合成pCDH-lnc-NEAT1。擴增目的片段，回收。水浴雙酶切基因片段和質粒載體pCDH，連接產物和載體。連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5α內，涂布于Luria-Bertani培養基上，培養箱內倒置過夜、篩選、測序鑒定，成功構建pCDH-lnc-NEAT1。慢病毒包裝:消化293T細胞，6孔板內培養，待細胞融合50%時，用上述攜帶目的片段的表達載體(2 μg)和病毒包裝質粒(3 μg pAX2、2 μg pMD2)共轉染293T細胞，培養48 h后，收集病毒上清液，過濾、分裝、-80 ℃保存。慢病毒轉染：病毒感染前24 h，消化OSCC3細胞，鋪6孔板，待細胞融合為30%時，上述病毒液感染OSCC3，同時加入2 μl的8×10g/L聚凝胺，培養24 h、換液，繼續培養。

1

.

3

.

4

qRT-PCR檢測lnc-NEAT1的表達水平 提取 plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc、plko.1-shlnc-NEAT1、lnc-NEAT1及其各自對照組的總RNA。逆轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。lncRNA NEAT1上游引物：CCAGGGTGGTGGCAGTGCTCC，下游引物：CACCCCAGCCTCAGCGGGAAG ；Actin上游引物：TCCATCATGAAGTGTGACG，下游引物：TACTCCTGCTTGCTGATCCAC。將配制好的擴增體系依次按順序加入8連管中，每組設置3個復孔，上機設置反應程序，預變性：95 ℃、2 min； PCR反應：95 ℃、5 s；60 ℃、15 s；72 ℃、 20 s，循環40次。記錄結果，以Actin作為分子內標，采用2法比較分析各組 lncRNA NEAT1的表達量。

1

.

3

.

5

Western blot檢測C-Myc蛋白的表達 RIPA裂解 plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc及其各自對照組的OSCC3細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，煮蛋白，凝膠電泳分離蛋白，轉膜，室溫下封閉2 h，抗體孵育，TBST充分洗膜，顯影，分析條帶灰度。

1

.

3

.

6

MTT比色法檢測OSCC3細胞生長 將轉染shlnc-NEAT1以及lnc-NEAT1后的OSCC3細胞按2×10個/孔接種于96孔板，每組設置3個復孔，培養箱內分別培養 6、12、24、48、72 h，每孔依次加入 MTT試劑 10 μl(5 g/L)，繼續培養4 h后，吸除各孔培養液，每孔加入DMSO 100 μl，低速振蕩10 min，檢測各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1

.

3

.

7

糖酵解壓力檢測OSCC3細胞能量代謝 將轉染lnc-NEAT1以及其對照組的OSCC3細胞按2×10個/孔傳代到安捷倫Seahorse XFe 96孔板，Seahorse基礎培養基加入1 mmol/L谷氨酰胺，預熱培養基到37 ℃，用0.1 mol/L NaO調節pH至7.4，繼續37 ℃保溫；96孔板每孔加入糖酵解壓力試劑后，按既定的糖酵解壓力程序開始檢測；結束后，對每孔的OSCC3細胞進行定量，根據結果再用Seahorse 結果分析軟件輸出結果。

2 結果

2.1 目標lncRNA的確定

檢測shctrl和shc-Myc的OSCC3細胞中lncRNA的表達情況。相關的長鏈非編碼RNA的表達已不同程度地下降。經過篩選后，篩選出3個目的長鏈非編碼RNA，分別為lncRNA H19、lncRNA NEAT1、lncRNA SNHG1；經過大量的文獻閱讀，得知長鏈非編碼RNA NEAT1參與多種腫瘤細胞的發生、增殖以及發展。同時，當C-Myc基因下調，結果中檢測到長鏈非編碼RNA NEAT1表達量降低，而且差異有統計學意義(

P

<0.05)。長鏈非編碼RNA NEAT1與口腔癌細胞的發生以及增殖，還未見詳盡的報道，因此，該課題組選擇了長鏈非編碼RNA NEAT1。lncRNA檢測數據見圖1。

圖1 敲低C-MycOSCC3細胞中lncRNA表達量變化與shctrl對照組比較：*P<0.05

2.2 口腔癌組織中lncRNA表達情況

15例癌組織中有13例組織lncRNA NEAT1表達量高于癌旁組織，10例口腔癌組織lncRNA NEAT1表達量高于癌旁組織的2倍多。結果顯示，lncRAN NEAT1在口腔癌組織中的高表達可能與口腔癌發展有關(

P

<0.05)，見圖2。

圖2 口腔癌組織以及癌旁組織中lncRNA NEAT1表達水平與癌旁組織組比較：*P<0.05

2.3 上調C-Myc對OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達的影響

Western blot檢測結果顯示flag-c-Myc組蛋白表達較flag對照組增高，見圖3A。qRT-PCR檢測結果顯示flag-c-Myc組lncRNA NEAT1的表達量高于flag對照組，見圖 3B。結果顯示，上調C-Myc可能提高OSCC3細胞的lncRNA NEAT1的表達水平(

P

<0.05)。

圖3 上調C-Myc對OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達水平的影響

2.4 敲低C-Myc對OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與shctrl對照組比較，shc-Myc組C-Myc蛋白表達降低，見圖4A。qRT-PCR檢測結果顯示shc-Myc組lncRNA NEAT1表達量較shctr對照組降低，見圖4B。結果顯示，敲低C-Myc可能降低OSCC3細胞的lncRNA NEAT1的表達水平(

P

<0.05)。

圖4 敲低C-Myc對OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達水平的影響

2.5 上調lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1組和對照(Control)組OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達水平。結果顯示，lncRNA NEAT1組OSCC3細胞中lncRNA NEAT1過表達(

P

<0.05)，見圖5A。MTT比色法檢測兩組細胞的增殖能力。結果顯示，與Control組相比，lncRNA NEAT1組轉染12 h時細胞增殖能力開始增加，直到72 h細胞增殖能力一直處于增加狀態，見圖5B。結果顯示，上調OSCC3細胞中lncRNA NEAT1，可能促進細胞增殖能力(

P

<0.05)。

圖5 上調lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

2.6 敲低lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

qRT-PCR檢測shlncRNA NEAT1組和對照(shControl)組OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達水平。結果顯示，shlncRNA NEAT1組OSCC3細胞中lncRNA NEAT1表達量降低(

P

<0.05)，見圖6A。MTT比色法檢測兩組細胞的增殖能力。結果顯示，與shControl組相比，shlncRNA NEAT1組轉染12 h時細胞增殖能力開始降低，直到72 h細胞增殖能力仍然持續降低，見圖6B。結果顯示，敲低OSCC3細胞中lncRNA NEAT1的表達可能降低細胞的增殖能力(

P

<0.05)。

圖6 敲低lncRNA NEAT1對OSCC3細胞增殖能力的影響

2.7 上調lncRNA NEAT1對OSCC3細胞的糖酵解水平的影響

糖酵解壓力實驗檢測上調lncRNA NEAT1的OSCC3細胞中的糖酵解產酸速率以及產生ATP的水平。結果顯示， lncRNA NEAT1組較Control組細胞糖酵解相對產酸速率以及產生ATP的相對水平均提高，見圖7A、B。因此，上調lncRNA NEAT1可能促進OSCC3細胞的糖酵解水平(

P

<0.05)。

圖7 上調lncRNA NEAT1對OSCC3細胞的糖酵解水平的影響

3 討論

Myc基因屬于原癌基因和調節基因，L-myc、N-myc和C-Myc組成了Myc基因，它們分別定位于1號染色體、2號染色體和8號染色體。根據Fan et al研究表明，失調的C-Myc可以與低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF1)共同作用于己糖激酶2(hexokinase 2 ，HK2)和丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)，影響線粒體氧化磷酸化作用，從而促進糖酵解。有研究表明，C-Myc可能通過負性調控lncRNA55，影響舌鱗癌細胞的生長。

lncRNA NEAT1是細胞核內的一個lncRNA，可以與一些核內蛋白結合形成亞核結構旁斑。據報道,lncRNA NEAT1在多種腫瘤中高表達，參與腫瘤的發展。研究表明，下調的lncRNA NEAT1通過減弱miR-193對腫瘤的促進作用，抑制腫瘤的發展。此外，lncRNA NEAT1通過負性調控miR-139-5p，促進其靶基因CDK6的表達，加速膠質瘤的進展。在子宮內膜癌中，lncRNA NEAT1靶向miR-146b-5p/MMP9分子軸，通過β-catenin/Wnt信號通路，參與子宮內膜癌的發展。在骨肉瘤中，高表達的lncRNA NEAT1通過負性調控miR-339-5p/TGF-β1，促進骨肉瘤的發展。

雖然，大量研究表明lncRNA NEAT1在多種惡性腫瘤中的表達水平呈現異常，然而，lncRNA NEAT1對口腔癌細胞的調控，迄今還未見詳盡的報道。該實驗通過將表達載體plko.1-shc-Myc以及flag-c-Myc轉染至OSCC3細胞中，檢測lncRNA NEAT1表達量，結果顯示過表達或者敲低C-Myc，lncRNA NEAT1的表達量呈現升高或者降低趨勢，推測C-Myc與lncRNA NEAT1的表達量可能呈現正相關關系。為進一步評估lncRNA NEAT1在OSCC3細胞的生物學功能，構建表達載體 plko.1-shlnc-NEAT1以及pCDH-lnc-NEAT1轉染至OSCC3細胞，檢測OSCC3 細胞的增殖水平，結果顯示過表達lncRNA NEAT1可能促進OSCC3細胞的增殖能力。糖酵解壓力實驗結果顯示過表達的lncRNA NEAT1可能提高OSCC3細胞的糖酵解水平，增強細胞的糖酵解代謝。

因此，在OSCC3細胞中C-Myc可能調控lncRNA NEAT1的表達，并且lncRNA NEAT1過表達可能提高OSCC3細胞的糖酵解代謝水平，促進口腔癌細胞的增殖能力以及口腔癌的發展。