糖尿病腎病患者腎臟巨噬細胞Bruton酪氨酸激酶激活與腎功能的相關性研究

聶振勇，趙 晶，孫璇君，吳永貴

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的主要并發癥之一，并已成為全世界終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因，目前缺乏有效的治療手段。DN的病理學改變主要包括系膜細胞的增殖和細胞外基質的累積，基底膜的增厚，腎小管及間質的損傷和纖維化。近年來，越來越多的研究表明，巨噬細胞介導的炎癥在DN中起著至關重要的作用。在DN的高血糖微環境下，巨噬細胞可以分泌多種促炎介質，其中包括白介素(interleukin, IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic protein, MCP)-1，進而導致腎臟內的炎癥和纖維化，加速疾病的進展。Bruton酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase,BTK)是一種非受體酪氨酸激酶，是多種免疫受體下游細胞內信號傳遞的關鍵蛋白。已有大量研究表明BTK可以參與體內的多種炎癥免疫反應，并參與了多種促炎介質的產生和釋放。課題組前期研究表明，高糖可以誘導巨噬細胞內BTK激活，引起巨噬細胞促炎介質的釋放，并且BTK敲除可以減輕炎癥，緩解糖尿病小鼠的腎臟損害。在此基礎上，該實驗旨在研究BTK激活在DN腎臟中的重要作用，為臨床的干預治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料

對照組：收集體檢正常志愿者血清18例及癌旁正常腎組織18例作為對照組。DN組：收集2016年1月—2020年1月在安徽醫科大學第一附屬醫院住院治療的DN患者腎組織為DN組，共49例。入組標準：18～60歲、診斷符合《糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)》的診斷標準、腎臟穿刺活檢確診為DN的患者。排除標準：妊娠或哺乳期婦女、合并其他繼發性腎病、入組前應用激素或免疫抑制劑、近1月有泌尿系或其他系統感染病史、有其他器官嚴重的功能不全、惡性腫瘤患者。臨床資料包括性別、年齡、糖化血紅蛋白、體質指數(body mass index,BMI)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)、24 h尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮、估計腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血尿酸。所有入組者均簽署知情同意書，該研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審核通過。

1.2 試劑與儀器

人IL-1β、TNF-α和MCP-1 ELISA試劑盒購自廣州銳博生物有限公司；TNF-α、CD68單克隆抗體購自臺灣Arigo Biolaboratories公司；BTK、Phospho-BTK單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；iNOS單克隆抗體購自英國 Abcam公司；免疫組化試劑盒( PV-9000)購自北京中杉金橋公司；免疫熒光二抗鼠Alexa Fluor 594 和兔 Alexa Fluor 488購自武漢三鷹生物技術有限公司；激光共聚焦顯微鏡LSM880購自德國Leica公司。病理切片標準：腎小球數目≥8個，經2位病理專家獨立診斷確診為DN。病理評級參考腎臟病理學會(RPS)2010年發表的糖尿病腎病的病理分類。

1.3 方法

1

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3

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1

ELISA實驗 收集各組血清，并通過ELISA檢測各組血清中IL-1β，TNF-α和MCP-1表達，檢測步驟參考說明書進行。

1

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3

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2

免疫組化實驗 腎組織切片常規脫蠟至水化，依次經內源性過氧化物酶阻斷劑封閉，高壓法修復抗原，10%山羊血清封閉，滴加一抗TNF-α(1 ∶200)、CD68(1 ∶200)、BTK(1 ∶400)，4 ℃孵育過夜(大于8 h)，沖洗后滴加二抗(辣根酶標山羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物)，37 ℃孵育30 min，沖洗后進行DAB顯色。所有切片在顯微鏡下隨機拍攝10個視野，通過Image J軟件進行半定量分析，計算棕色陽性位點或棕色陽性面積占比，最后計算出各組平均值用于統計學分析。

1

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3

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3

免疫熒光實驗 腎組織切片常規脫蠟至水化，依次經內源性過氧化物酶阻斷劑封閉，高壓法修復抗原，10%山羊血清封閉，滴加一抗CD68(1 ∶200)、iNOS(1 ∶200)、BTK(1 ∶400)、p-BTK(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，沖洗后滴加二抗(抗小鼠 Alexa Fluor 594 和抗兔 Alexa Fluor 488)，室溫下避光孵育2 h，DAPI染核10 min，甘油封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 一般臨床指標

與對照組相比，DN組糖化血紅蛋白、SBP、DBP、MAP、24 h尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮、血尿酸明顯升高，eGFR明顯下降，差異有統計學意義(

t

=7.726，

t

=2.959，

t

=2.219，

t

=2.828，

Z

=-6.083，

Z

=-5.333，

t

=4.894，

t

=4.240，

t

=6.394，均

P

<0.05)；年齡、性別及BMI差異無統計學意義。見表1。

表1 對照組及DN組的一般臨床指標比較

2.2 各組血清及腎臟中炎癥變化

ELISA結果顯示，與對照組相比，DN組血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1均明顯升高，差異有統計學意義(

t

=3.868，

t

=3.088，

t

=13.690，均

P

<0.05)，提示DN患者血清中炎癥介質增加。見圖1A。免疫組化結果顯示，DN組腎臟中TNF-α表達高于對照組(

t

=3.418，

P

<0.05)，提示DN患者腎組織中炎癥同樣增加。見圖1B。

圖1 各組血清中IL-1β、TNF-α和MCP-1表達及腎臟中TNF-α表達差異

2.3 各組腎組織CD68、BTK、p-BTK表達變化

免疫組化結果顯示，相較于對照組，DN組腎小球和腎小管中的CD68、BTK和p-BTK表達均明顯增加(

t

=5.774，

t

=6.119，

t

=4.542，

t

=7.315，

t

=6.760，

t

=7.610，均

P

<0.05)，提示DN患者腎組織中巨噬細胞浸潤增加，并伴有BTK表達與激活增加。見圖2。

圖2 各組腎組織中CD68、BTK及p-BTK表達變化 ×400免疫組化檢測各組腎小球及腎小管間質中CD68、BTK及p-BTK表達變化；與對照組比較：*P<0.05

2.4 各組腎組織CD68與iNOS、p-BTK共表達

激光共聚焦結果顯示，與對照組相比，DN組腎臟內巨噬細胞浸潤增加，并且巨噬細胞內iNOS與p-BTK表達增加，提示DN腎臟中巨噬細胞激活，并且BTK磷酸化參與了該過程。見圖3。

圖3 DN組腎組織中CD68與iNOS、p-BTK共表達 ×400

2.5 DN組腎臟BTK表達與臨床指標的相關性分析

該實驗將年齡、性別、糖化血紅蛋白、SBP、DBP、MAP及血尿酸作為控制因素，分別對腎小球及腎小管間質內BTK表達與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐及血尿素氮進行線性相關分析。結果顯示，DN組腎小球BTK表達與24 h尿蛋白(

R

=0.511,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.339,

P

=0.026)呈正相關，與eGFR呈負相關(

R

=-0.386,

P

=0.011)，腎小球內BTK表達與血尿素氮無明顯相關性(

R

=0.191,

P

=0.220)；同時，腎小管間質內BTK表達與24 h尿蛋白(

R

=0.550,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.453,

P

=0.002)及血尿素氮(

R

=0.355,

P

=0.019)也呈正相關，與eGFR呈負相關(

R

=-0.451,

P

=0.002)，提示腎臟內BTK的表達與DN患者的臨床指標具有顯著的相關性。見圖4。

圖4 DN組腎小球及腎小管間質中BTK表達與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐、血尿素氮相關性分析

2.6 DN組腎臟p-BTK表達與臨床指標的相關性分析

該實驗對腎小球及腎小管間質內p-BTK的表達與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐及血尿素氮進行線性相關分析。結果顯示，DN組腎小球p-BTK表達與24 h尿蛋白(

R

=0.671,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.482,

P

=0.001)及血清尿素氮(

R

=0.421,

P

=0.004)均呈正相關，與eGFR呈負相關(

R

=-0.458,

P

=0.002)；同時，腎小管間質內p-BTK表達與24 h尿蛋白(

R

=0.552,

P

<0.001)、血清肌酐(

R

=0.455,

P

=0.002)及血尿素氮(

R

=0.359,

P

=0.017)也呈正相關，與eGFR呈負相關(

R

=-0.454,

P

=0.002)，提示腎臟內BTK的磷酸化激活與DN患者的臨床指標同樣具有很強的相關性。見圖5。

圖5 DN組腎小球及腎小管間質中p-BTK表達與24 h尿蛋白、eGFR、血清肌酐、血尿素氮相關性分析

3 討論

隨著社會的發展，糖尿病的患病率呈逐年上升的趨勢。目前全球有4.15億人患有糖尿病，估計有1.93億人未診斷出糖尿病。2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上，并且大約30%～40%的糖尿病患者會發展為腎病。DN給患者及社會都帶來了嚴重的經濟負擔，因此，其預防與治療成為目前亟需解決的難題。

DN的發病機制復雜，目前大多認為是由于機體的高血糖微環境導致代謝及血流動力學的紊亂引起了腎臟疾病，但隨著研究的深入，大量研究表明炎癥在DN的整個病程期間均起著重要作用，并決定著疾病的發展方向。高糖環境下可誘導多種炎癥細胞(包括巨噬細胞、T細胞、肥大細胞)浸潤，其中巨噬細胞在DN患者的腎臟活檢組織和實驗動物模型腎組織均有發現浸潤，并且巨噬細胞浸潤程度與腎損害的嚴重程度和纖維化程度相關。巨噬細胞可通過多種機制介導腎損傷，包括活性氧(ROS)、細胞因子和蛋白酶等的產生，這些損傷介質可以導致腎臟的炎癥并最終引起纖維化改變。該研究表明，DN患者血清中促炎介質表達升高，并且DN患者腎組織中TNF-α表達增加，巨噬細胞浸潤及激活增加。DN患者血清中的促炎趨化因子可以招募巨噬細胞進入腎臟，同時高糖環境可以誘導巨噬細胞的激活，引起腎臟內炎癥的增加進而參與疾病的進展。

Bruton酪氨酸激酶(BTK)是Tec胞質酪氨酸激酶家族的成員，主要在髓系造血細胞中表達。除了其在B細胞中的重要調控作用外，BTK還參與調節巨噬細胞活化和促炎性細胞因子產生的Toll樣受體(TLR)信號通路，而后者在DN的進展中起著重要作用。課題組前期研究表明，高糖可以激活骨髓來源的巨噬細胞中BTK表達，并且通過激活下游的NF-κB 信號通路，進而誘導促炎介質的釋放，而BTK抑制后可以減輕該過程。該研究結果顯示，DN患者腎組織中BTK的表達與激活增加，并且免疫熒光共標結果顯示，BTK可以在巨噬細胞中激活。通過進一步的數據分析，研究表明DN組腎組織中腎小球和腎小管內BTK及p-BTK的表達均與24 h尿蛋白和血清肌酐呈正相關，與腎小球濾過率呈負相關，并且腎小管間質中的BTK表達與血尿素氮呈正相關，腎小球及腎小管間質中p-BTK的表達均與血尿素氮呈正相關。這提示BTK介導的炎癥反應在DN的疾病進程中有著重要的作用，BTK可以作為DN的潛在治療靶點。

DN目前缺乏有效的治療手段，而減輕腎組織的炎癥對于延緩疾病的進程有著重要的作用。該研究表明DN患者微循環和腎臟內炎癥的增加，并且該過程與巨噬細胞和BTK的激活有著重要的聯系。BTK的表達與DN患者的臨床指標有著重要的相關性。該研究具有重要的臨床意義且可能為DN的治療提供了新的思路。