綠茶提取物EGCG預防齲病的動物實驗研究

李 芳，劉亞軍，劉澤婷，陳永翔，王烈成，王一君，王元銀

齲病是一種細菌感染性疾病，由含有變形鏈球菌(

streptococcus

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，

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)的口腔生物膜誘導下牙體硬組織發生的病變。現有研究表明大量的致齲細菌是齲病的致病因素，而

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是齲病的主要病原微生物。

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黏附于牙面獲得性膜上，迅速繁殖、代謝碳水化合物產酸，溶解牙體硬組織進而形成齲洞，這是其致齲特性。表沒食子兒茶素沒食子酸酯( epigallocatechin gallate，EGCG)在兒茶素中含量最多，具有廣泛的生物學和藥理活性。它還具有較高的抗齲功效，這一特性主要來源于它的抗菌活性，其作用機制與它的化學結構有關。有研究表明，EGCG對口腔主要致齲細菌的產酸、耐酸以及黏附等致齲毒力因子有較好的抑制作用。且有學者證實EGCG在抑菌、保護神經系統及抗氧化等方面起重要作用。該課題前期研究表明EGCG對

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的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為 6.25 mg/L。該研究利用大鼠齲病模型對綠茶提取物EGCG在 MIC時的防齲效能進行綜合評估，為綠茶提取物EGCG進入臨床試驗提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

EGCG、氨芐西林鈉購自北京索萊寶科技有限公司；氟化鈉、醋酸氯己定(洗必泰)、紫脲酸銨指示劑均購自上海易恩化學技術有限公司；頭孢拉定膠囊購自石家莊石藥集團歐意藥業有限公司；蔗糖購自美國Sigma 公司； SYTO 9染料購自美國賽默飛世爾科技公司；NEST 801001 35 mm 玻底培養皿(玻底直徑20 mm)購自無錫耐思生物科技有限公司；SYJ-160型低速金剛石切割機購自沈陽科晶自動化設備有限公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國卡爾·蔡司公司；熒光正置顯微鏡DMI6000B購自德國徠卡儀器有限公司。

1.2 細菌與培養基

國際標準變異鏈球菌株 ATCC 25175 (血清型C型 ) ；牛腦心浸出液培養基(brain heart infu- sion，BHI) 購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；輕唾瓊脂培養基(MS 瓊脂)、桿菌肽(bacitracin)均購自北京索萊寶科技有限公司等。

1.3 實驗動物

SD 大鼠24只購自安徽醫科大學實驗動物中心；2000# 致齲飼料購自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.4 細菌復蘇及培養

按照說明書配制BHI瓊脂培養基和MS瓊脂培養基。將于-80 ℃凍存的

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株室溫復蘇24 h后接種于BHI瓊脂培養基和MS瓊脂培養基，取0.5 ml菌液和4.5 ml BHI液體培養基放入15 ml離心管中混勻，37 ℃厭氧環境 (10% CO、90% N) 培養48 h。BHI瓊脂培養基形態學觀察為無特征性乳白色菌落；在超凈工作臺中用移液槍移取適量菌液涂片革蘭染色后顯微鏡觀察為藍色鏈球狀。確認是純培養后接種于BHI液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h,使用 BHI液體培養基調節菌液濃度備用，使其達到吸光度值OD=0.6。

1.5 EGCG混懸液的配制

將EGCG粉用滅菌蒸餾水配制成100 mg /L的母液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存待用。使用前用滅菌蒸餾水按設定濃度稀釋后使用。

1.6 動物實驗

1

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6

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1

實驗分組及細菌接種 選擇均于出生后第21天斷乳的SD雄性大鼠24只，隨機分成4組(

n

=6)：EGCG、氟化鈉(NaF)、氯己定(CHX)及蒸餾水(對照)組，給大鼠打耳標、記錄體質量。給予大鼠普通飼料適應性喂養2 d，之后給予致齲飼料 2000# 和 5%蔗糖水溶液，直至整個實驗結束。鼠齡22 d，異氟烷吸入麻醉，用無菌棉簽蘸取大鼠唾液，PBS稀釋后涂BHI瓊脂平板和MS瓊脂平板，觀察大鼠口腔內固有菌群情況。在實驗第3～6天期間給予廣譜抗生素抑制口腔菌群，即1 000 g致齲飼料添加1 g氨芐西林、1 L 5%蔗糖水溶液添加頭孢拉定1 g促進

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感染大鼠口腔。在實驗第8～12天期間，給每只大鼠口腔內接種國際標準變異鏈球菌株，菌液濃度為OD=0.6，每次接種1 ml/只，連續處理5 d。在大鼠圍術期每組隨機抽取3只大鼠，用消毒棉簽收集大鼠唾液檢測菌株接種情況。

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6

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2

大鼠口腔藥物處理 自實驗第14天起分別用濃度為 MIC的 EGCG、250 mg/L NaF溶液、0.12% CHX溶液及蒸餾水沖洗大鼠口腔。取1 ml各藥液分裝至1.5 ml EP管 ，1鼠1支。每只鼠在用藥前放入裝有3～4個浸滿異氟烷棉球的誘導盒內，隨即關閉盒蓋，等待大鼠完全麻醉 (此過程約需 2～3 min)。可通過輕輕搖動誘導盒以檢查大鼠是否完全麻醉，若大鼠身體翻倒為側姿且沒有試著恢復其臥姿狀態，則表明該大鼠已經完全麻醉。將大鼠從誘導盒中迅速拿出，左手持大鼠并用拇指和食指固定住其頭部，右手拿無菌棉簽蘸取藥液至飽和，對大鼠磨牙(牙合)面、頰面、舌/腭面及口腔黏膜各處依次清理，剩余藥液用鈍頭的1 ml注射器沖洗大鼠口腔，以確保藥液作用到位。每只鼠的藥物處理過程為 1 min，處理后將大鼠以側臥位放回鼠籠，所有大鼠蘇醒后禁食2 h，如此連續處理6周，早晚各1次。整個藥物處理過程始終由同一實驗員操作完成。同時每天觀察并記錄大鼠健康狀況飲食情況，每周記錄1次大鼠體質量。

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6

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3

大鼠磨牙標本的制取 實驗第56天異氟烷窒息處死大鼠，稱重后用剪刀斷顱，將上下頜骨分開，用組織剪剔除附在骨面的皮膚肌肉筋膜等軟組織獲取頜骨標本。清洗干燥置于含有1%～2%氫氧化銨溶液的燒杯中浸泡30 min,薄膜封口。取出清洗用濾紙干燥，置于0.4% 紫脲酸胺溶液中避光染色12 h，染色液中加入一定量的10%中性甲醛可以防止頜骨腐爛。取出沖洗室溫下避光干燥，將大鼠頜骨用蠟固定在切割機虎鉗上，用低速金剛石切割機沿頜骨磨牙牙合面近遠中向矢狀半切，清洗干燥后放入裝有苯的玻璃皿中增加確認率，立即清潔標本，在體視顯微鏡下根據Keyes評分法評估大鼠磨牙的齲損情況。

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4

齲齒Keyes評分法分級計分 Keyes評分法是一種評估大鼠磨牙齲損程度的傳統的計分系統，在下頜第一、第二和第三磨牙中檢查的窩溝數目分別為3、2和1。在上頜第一、第二和第三磨牙中分別為2、1和1。分配給每個磨牙窩溝的線性單位分別是：上頜分別為7、5和2；下頜分別為5、3和2。其中下頜第一磨牙的前溝被指定2個單位的值，并用作其他溝測量的指導或標準。使用4 種探診深度記錄方式[齲損局限于釉質(E 級)；齲損累及釉質及牙本質外層 1/4 以內(Ds級)，會出現牙本質與上層牙釉質略微分離；齲損累及牙本質厚度1/4 ～ 3/4(Dm級)；齲損累及深度超過牙本質厚度的3/4，甚至穿透牙本質全層(Dx級)]評估大鼠磨牙的窩溝齲損情況。對大鼠磨牙的窩溝齲損進行計分，以此來評定藥物抑制齲齒情況。其中鏡下呈粉紅色處是齲損部位，不著色或著色很淺處是正常牙體組織。

2 結果

2.1

的培養與鑒定

實驗中分別在細菌復蘇后，接種前及接種后都對細菌進行菌落的形態和革蘭染色，形態學觀察為無特征性乳白色菌落；革蘭染色后顯微鏡觀察顯示細菌呈藍色鏈狀結構，見圖1。結果表明接種細菌為

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，并在大鼠口腔成功定植。

2.2 大鼠的飲食與健康狀況

實驗過程中對大鼠的水和食物消耗進行記錄，各組間未見較大差異。口腔藥物處理期間，大鼠的健康活動狀況良好，口腔黏膜未見異常表現，各組大鼠的體質量相對均勻增加，實驗結束時各組大鼠體質量增加差異無統計學意義(

F

=1.83，

P

>0.05)，結果見表1。

表1 實驗中大鼠的體質量變化

2.3 大鼠上頜磨牙窩溝齲損的Keyes記分

觀察大鼠上頜磨牙牙合面，各組大鼠磨牙窩溝均出現不同程度的齲損。在E級齲齒計分中，與對照組相比，EGCG組計分降低(

F

=22.09，

P

<0.001)；在Ds、Dm級齲齒計分中，3組用藥組上頜磨牙Keyes計分分值均降低，但CHX組抑齲效果更好(

P

=0.001 5；

P

=0.000 1)；在Dx級齲齒計分中，與對照組比較，其余各組的齲齒計分均降低很多，且差異有統計學意義(

F

=31.66，

P

<0.001)，顯示各用藥組都有一定的預防窩溝齲齒的作用(表2)，各用藥組間齲齒計分差異無統計學意義，大鼠磨牙各種窩溝齲損模型見圖2。

表2 各組大鼠上頜磨牙窩溝齲齒的Keyes計分

圖1 變形鏈球菌鑒定

圖2 各種齲齒模型 紫脲酸銨染色×10

3 討論

齲齒是世界上最常見的口腔疾病之一，是一種細菌感染性疾病。

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被認為是齲齒發病的主要病因，具有較強的產酸、耐酸性和檢出率高等特性。齲齒的發生幾乎與細菌對碳水化合物的代謝有關，特別是

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代謝碳水化合物后產生的酸，將降低口腔中的pH，反過來對口腔微生物群施加生理壓力。由于其耐酸的特性，

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比不耐酸的物種有競爭優勢，當環境條件不太有利時，

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在致齲菌斑數量上占主導地位。它能代謝多種碳水化合物，黏附在牙齒表面，形成生物膜。據報道，

S.

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的高數量與齲齒率的增加有直接關系。EGCG是兒茶素的一種，具有廣泛的生物學和藥理活性。此外，它還具有較高的抗菌功效，其作用機制與它的化學結構有關。此外它還具有很強的抗氧化活性，可以減少酸性化合物的產生，并通過對細菌胞質膜的不可逆性損傷，發揮對口腔鏈球菌的抗菌作用。有研究表明，EGCG對口腔主要致齲細菌的產酸、耐酸以及黏附等致齲毒力因子有明顯的抑制作用。除了已知的抑菌作用外，EGCG可能還抑制

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對牙齒表面的黏附，從而破壞成熟生物膜形成的最初步驟，減少齲齒的發生。該課題組的前期體外研究表明:EGCG 對

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的MIC為 6.25 mg/L，說明當藥物濃度≥6.25 mg/L就可以抑制

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的增殖。MIC的EGCG對

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的產酸、增殖及黏附有較好的抑制作用。由于細菌-食物-宿主間相互作用的復雜性，研究人員不得不使用動物模型，在控制條件下研究齲齒病變。當喂食致齲食物時，嚙齒動物的牙齒可發展齲齒，盡管人類和嚙齒動物的牙齒解剖結構不同，但由于它們較易獲得且成本較低，開始被應用于齲病的研究。目前關于EGCG對

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作用的研究多集中于體外，尚缺乏EGCG對

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致齲能力影響的體內實驗研究。該研究的目的是利用大鼠齲病動物模型研究最低抑菌濃度的EGCG在大鼠口腔內對

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致齲能力的抑制作用。調查EGCG對

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的生長及其體內致齲潛力的影響。Keyes 齲齒計分統計結果顯示，EGCG組窩溝面齲損程度少于對照組，且對牙本質深齲有較好的防治作用。表明EGCG具有抑制齲病發生發展的作用。該研究結果發生的機制可能與前期體外實驗的結果一致：EGCG可以抑制變鏈菌的生長黏附、降低牙菌斑的聚集及抑制葡萄糖基轉移酶(GTF)的活性。最后，對EGCG的防齲效能進行了綜合評估：Keyes 計分表明MIC的EGCG能夠抑制大鼠窩溝齲損形成和嚴重程度。此外，在整個實驗過程中，各組大鼠一般健康狀況良好，體質量均勻增長，口腔黏膜未見異常表現，與對照組相比飲食的消耗差異無統計學意義，結果顯示實驗藥物經口腔局部應用具有良好的安全性。

該研究表明，MIC的EGCG可減少大鼠磨牙窩溝齲的發生并降低齲損嚴重程度，且對大鼠飲食和體質量的變化無影響。同課題組前期體外研究結果，從多方面驗證了EGCG對口腔致齲菌的抑制作用，表明天然藥物EGCG能抑制大鼠口腔變形鏈菌的生長代謝，可有效預防齲齒的發生，為齲病的防治提供更多的實驗依據。推測EGCG可能作為一種天然、安全的防齲藥物，在防治齲病方面發揮重要作用。