去乙酰化酶SIRT6通過激活PI3K-AKT通路促進腎癌細(xì)胞增殖、遷移

李天宇，汪 鑫，張 森，畢良寬，王德光

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是腎臟中最常見的惡性腫瘤。在過去的10年中，RCC的發(fā)生率以每年2%的速度增長。轉(zhuǎn)移和化療耐藥性是RCC的特征。由于缺乏有效的治療方法，RCC患者的中位生存時間僅為6～12個月，而5年生存率不到20%。最近的研究表明，超過90%的腎癌相關(guān)死亡與RCC的轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，迫切需要確定新的治療靶點。

SIRT6是NAD依賴的去乙酰化酶Sirtuins家族成員之一，在染色質(zhì)信號傳導(dǎo)和基因組維持中已確定作用。通過這些功能，SIRT6可以預(yù)防與衰老相關(guān)的疾病，包括代謝性疾病和癌癥，并可以延長小鼠的壽命。在RCC發(fā)展過程中，SIRT6的表達(dá)是否發(fā)生變化及其對RCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控尚不清楚。該研究通過RCC患者組織及細(xì)胞系，觀察SIRT6在RCC發(fā)展中的表達(dá)及其對RCC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hycolne公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)；轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME transfection reagent(法國Polyplus-transfection公司)，RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，小干擾RNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，Western blot SIRT6抗體(英國Abcam公司)，免疫組化SIRT6抗體(美國Proteintech公司)，兔二步法試劑盒(北京中杉金橋公司)，兔源H3、H3K9ac、GAPDH、Akt、p-Akt抗體和山羊抗兔二抗(美國Affinity公司)，兔源β-Tubulin(美國Cell signaling technology公司)，二甲基亞砜(美國Sigma公司)，OSS_128167粉末(美國MCE公司)。

1.2 病例資料

從安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科調(diào)取術(shù)后17例患者的腎癌組織和癌旁組織切片，腎癌組織類型皆為透明細(xì)胞癌，同時患者已簽署知情同意書。人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O細(xì)胞購自ATCC，使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染選擇在對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照說明書將SIRT6-siRNA轉(zhuǎn)染到ACHN、786-O細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染48 h后用于劃痕實驗或收集細(xì)胞蛋白等。

1.4 細(xì)胞加藥處理

將OSS_128167粉末離心后溶于DMSO中，并配制成用藥濃度為50、100、200 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后進行MTT及劃痕實驗，并收集細(xì)胞蛋白。

1.5 Western blot免疫印跡法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

RIPA法提取處理后的細(xì)胞總蛋白，通過SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，隨之ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光圖像系統(tǒng)分析系統(tǒng)進行圖片拍照，Image J對圖像進行半定量分析。

1.6 劃痕實驗

將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，待貼壁后用1 ml槍頭從上到下用力劃出一條痕跡，拍照記錄，后續(xù)每隔6 h進行1次拍照，直至24 h最后1次拍照，測量劃痕兩側(cè)細(xì)胞之間的面積用來計算24 h細(xì)胞愈合率。

1.7 四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活力

將細(xì)胞種于96孔板中，每孔含有細(xì)胞2 000個，并加入藥物OSS_128167進行24 h刺激，濃度分別為50、100、200 μmol/L，每組做10個復(fù)孔。每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔再加入10 μl Formazan溶解液并適當(dāng)混勻放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，3～4 h后顯微鏡下觀察到紫色Formazan結(jié)晶全部溶解則移至酶標(biāo)儀處測570 nm處吸光度。

1.8 免疫組織化學(xué)染色

將切片放置在枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱至沸騰使溫度維持在90～100 ℃、7 min，再沸騰1次，PBS緩沖液沖洗3次(每次5 min)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，PBS沖洗3次(每次5 min)，4 ℃一抗孵育過夜，PBS沖洗3次(每次5 min)，顯色增強劑孵育30 min，PBS沖洗3次(每次5 min)，酶標(biāo)山羊抗兔IgG二抗孵育30 min，PBS沖洗3次(每次5 min)，DAB顯色。

1.9 Transwell遷移實驗

將細(xì)胞消化后接種在含200 μl無血清培養(yǎng)基的小室中，24孔板里放入800 μl含30%小牛血清的培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱24 h，取出并加入4%多聚甲醛固定30 min，再加入0.1%結(jié)晶紫染色8 min，PBS清洗3次后用棉簽輕擦小室上部，放于顯微鏡下拍照。用Image J計算穿過小室的細(xì)胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，方差齊性檢驗采用Brown-Forsythe校正，兩獨立樣本之間采用

t

檢驗。以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Transwell的細(xì)胞數(shù)計算和劃痕實驗的細(xì)胞愈合率采用Image J進行定量或半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 SIRT6在人腎癌組織和腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)

從17例病人中隨機選取了3例腎透明細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織，免疫組化結(jié)果顯示：腎癌組織中SIRT6的表達(dá)明顯升高，而癌旁組織中SIRT6幾乎不表達(dá)，見圖1A。同時選取人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O和正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2檢測SIRT6的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，與HK-2細(xì)胞比較，SIRT6在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O中表達(dá)分別升高1.43倍(

t

=8.409，

P

<0.01)和1.22倍(

t

=4.122，

P

<0.05)，見圖1B。

圖1 SIRT6在腎癌中的表達(dá)變化

2.2 干擾SIRT6對ACHN細(xì)胞遷移能力的影響

使用SIRT6-RNAi干擾ACHN細(xì)胞。合成的3條siRNA片段用于進行SIRT6的干擾，Western blot結(jié)果顯示，與Vector組比較，SIRT6-siRNA1能夠顯著降低ACHN細(xì)胞中SIRT6的表達(dá)(

F

=72.01，

P

<0.01)，故選用siRNA1進行后續(xù)實驗，見圖2A。ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT6-siRNA后，與Vector組比較，SIRT6下游蛋白H3K9乙酰化水平顯著升高(

F

=10.89，

P

<0.001)，而H3總蛋白表達(dá)沒有明顯變化，見圖2B。劃痕實驗結(jié)果表明，與Vector組比較，SIRT6-siRNA轉(zhuǎn)染后ACHN細(xì)胞劃痕愈合面積較小，提示其遷移能力明顯減弱(

F

=149.4，

P

<0.01)。Transwell實驗結(jié)果顯示，與Vector組比較，轉(zhuǎn)染SIRT6-siRNA轉(zhuǎn)染后ACHN穿過小室的細(xì)胞數(shù)較少(

F

=59.27，

P

<0.01)，遷移能力明顯降低，見圖2C、D。

圖2 SIRT6-siRNA對ACHN的影響

2.3 SIRT6特異性抑制劑OSS_128167對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響

Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，隨著OSS_128167(50、100、200 μmol/L)濃度的增加(

F

=96.27，

P

<0.001)，在ACHN細(xì)胞中乙酰化H3K9蛋白表達(dá)逐漸升高，而對SIRT6蛋白和H3總蛋白表達(dá)無影響(圖3A)。MTT結(jié)果顯示，不同濃度的OSS_128167(50、100、200 μmol/L)處理24 h后，與DMSO組比較，ACHN的增殖活力隨著用藥濃度提高而顯著降低(

F

=43.39，

P

<0.001)(圖3B)。

圖3 OSS_128167對ACHN細(xì)胞SIRT6、H3K9ac表達(dá)和增殖活力的影響

2.4 SIRT6特異性抑制劑OSS_128167對腎癌細(xì)胞ACHN中PI3K、AKT表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，不同濃度OSS_128167(50、100、200 μmol/L)處理ACHN細(xì)胞后，隨著濃度的升高，p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)逐漸降低(

F

=84.66，

P

<0.001；

F

=23.39，

P

<0.001)，而PI3K、Akt蛋白的表達(dá)沒有明顯變化，見圖4。

圖4 OSS_128167對PI3K/AKT信號通路的影響

3 討論

腎癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜，尚未能完全明確，且面臨治療方法敏感性較差，腫瘤耐藥等問題，因此，確定新的腎癌治療靶點和藥物是當(dāng)前腎癌研究的關(guān)鍵。

Sirtuins家族包含7個NAD依賴性酶(SIRTs1-7)，它們涉及衰老、代謝和癌癥等多種途徑，因此，其被認(rèn)為是細(xì)胞活動的主要調(diào)節(jié)劑。SIRT6作為家族成員之一，對SIRT6的研究從最初的衰老和長壽的調(diào)控到近幾年在腫瘤，多樣化的功能使其能夠參與基因組的穩(wěn)定性、DNA修復(fù)、癌癥及代謝的調(diào)節(jié)，由于這些過程與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系，因此，SIRT6也被認(rèn)為是癌癥研究中較有吸引力的靶標(biāo)。

SIRT6在各種癌癥中失調(diào)，SIRT6在腫瘤發(fā)生中的作用取決于腫瘤的類型和背景。在胰腺癌、乳腺癌、原發(fā)性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌中，SIRT6在這些表達(dá)升高的癌癥中可能代表了一種對抗腫瘤進展的補償機制，在多發(fā)性骨髓瘤中SIRT6表達(dá)的增加，可以增強H3K9的脫乙酰基作用并抑制MAPK/ERK的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這些研究表明，細(xì)胞中SIRT6活性的調(diào)節(jié)隨腫瘤類型和癌癥分期而變化，反映SIRT6在癌細(xì)胞生物學(xué)中的復(fù)雜機制和多效作用。

在以往的研究中，腎癌中SIRT6表達(dá)水平尚有爭議：腎癌的免疫組化顯示SIRT6表達(dá)升高，且SIRT6抑制通過阻滯腎癌細(xì)胞786-O的G/S期來抑制腫瘤生長，而在另外的研究中，腎癌組織的免疫組化提示SIRT6的表達(dá)顯著低于正常組織。在該研究中，結(jié)果顯示SIRT6在腎癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，提示SIRT6的異常表達(dá)可能在腎癌進展中發(fā)揮調(diào)控作用。SIRT6-siRNA干擾ACHN細(xì)胞后，隨后通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗表明了SIRT6蛋白的下降能抑制腎癌細(xì)胞遷移。由于藥物的毒性和耐藥性，治療腎癌的手段選擇有限。

OSS_128167作為SIRT6的特異性抑制劑已經(jīng)被以往的研究證明，SIRT6作為NAD依賴性去乙酰化酶，OSS_128167與NAD的煙酰胺(NAM)部分的結(jié)合位點非常接近。抑制劑部分占據(jù)了肽底物結(jié)合位點，隨后阻止了活性組氨酸朝向NAD定向以進行反應(yīng)。OSS_128167可以通過抑制SIRT6的活性而不影響SIRT6蛋白表達(dá)而提高SIRT6的特異性下游靶標(biāo)H3K9的乙酰化水平。細(xì)胞增殖實驗所示，SIRT6的活性可被OSS_128167所抑制并且降低腎癌細(xì)胞的增殖。進一步的藥物代謝動力學(xué)研究仍有必要，以確定OSS_12816單獨使用或與其他藥物聯(lián)合使用的劑量和不良反應(yīng)。

PI3K/AKT是一種眾所周知的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著不可或缺的作用。PI3K/AKT作為經(jīng)常被激活的癌癥驅(qū)動因子在遺傳上比其他生長因子信號途徑靶向更多的途徑組成成分和更多的腫瘤類型。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中報道SIRT6在PI3K/AKT信號通路中富集，shSIRT6可抑制PI3K/AKT通路的磷酸化激活，該研究中SIRT6活性被OSS_128167抑制后出現(xiàn)PI3K/AKT磷酸化的抑制，說明SIRT6誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路的激活可能是腎癌發(fā)展的重要分子機制，但需要進一步研究來證明SIRT6調(diào)控該通路的生物學(xué)機制和信號串?dāng)_。