慢病毒載體上調GADD45α增強伊馬替尼耐藥株K562IR細胞的藥物敏感性

劉雪妮，王 超，程艷紅，楊 鵬

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是早期多能造血干細胞來源的惡性骨髓增生性疾病，它的細胞遺傳學的特點是存在費城(Ph)染色體t(9;22)(q34;qll)的相互易位，這些染色體的易位誘導形成了一個獨特的BCR-ABL基因，隨后ABL蛋白的失調導致CML細胞增殖能力增強，抗凋亡能力減弱，并改變關鍵的黏附性。CML在癌癥治療歷史上的一個重大進展就是甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate, IM)的出現，它是一種半特異性的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine-kinase inhibitor，TKI)，可以有效減少BCR-ABL mRNA的表達，并產生極高的完全血清學反應(CHR)和細胞遺傳學反應(CCyR)。但是類似于其他化療藥物，IM也會出現耐藥性，已知的耐藥機制主要有BCR-ABL過表達與BCR-ABL擴增相關，以及耐多藥P-糖蛋白(MDR-1)過表達，更常見的機制是在BCR-ABL激酶結構域的點突變的存在。GADD45α基因是一種重要的抑癌基因，在DNA修復、細胞周期阻滯、凋亡、血管生成抑制、衰老、信號轉導和DNA去甲基化中發揮重要作用，GADD45α缺失可加速BCR-ABL驅動的CML，導致更具侵襲性的疾病發展。該課題組前期研究表明，GADD45α基因上游起負調控作用的miR-362-5p在IM耐藥的K562細胞(K562IR)中的表達是在IM敏感的K562細胞中的4.2倍。因此，該研究推測CML細胞K562對IM的耐藥可能與GADD45α表達調控有關，該研究通過過表達基因等方法，探討GADD45α對耐藥株K562IR細胞的影響。

1 材料與方法

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1 試劑與儀器

人慢性髓系白血病細胞K562、 IM耐藥細胞K562IR購自中國科學院上海細胞生物學研究所，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及RPMI 1640培養液均購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素(PS)購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Molecular Technologies公司，慢病毒載體(滴度9×10TU/ml)及對照載體(滴度2×10TU/ml)均購自上海Genepharma公司，嘌呤霉素購自北京索萊寶科技有限公司，逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，Annexin V、PI細胞凋亡抗體購自美國BD公司，RIP裂解液、蛋白酶抑制劑及BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司，Anti-GADD45α兔單克隆抗體和HRP標記的二抗購自德國Santa Cruz Biotechnology公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Western blot電泳儀和凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad公司，流式細胞儀、流式細胞分析軟件和實時熒光定量PCR儀(qRT-PCR)購自美國BD公司。

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2 細胞培養及轉染

細胞復蘇后培養于1640完全培養基(10% FBS，1% PS和RPMI 1640的培養液)，37 ℃，5% CO飽和濕度下培養，適時換液、傳代。取對數期的細胞進行轉染。將K562和K562IR細胞按4×10/孔接種于24孔板內。設置K562不做轉染作為對照組、K562IR分別轉染慢病毒空載和含GADD45α的慢病毒作為陰性對照組和實驗組，分別命名為K562、Lv-NC和Lv-GADD45α，將慢病毒稀釋在細胞維持培養基中加入聚凝胺(5 μg/ml)，后加入到相應的細胞孔板中，12～24 h移去細胞侵染后的病毒液，加入完全培養基，37 ℃，5% CO過夜，72 h后熒光顯微鏡觀察GFP表達情況。

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3 穩定表達細胞系的篩選

為了篩選出穩定表達的細胞株，將慢病毒載體中設計Puromycin抗性，將細胞置于含有2 μg/ml的嘌呤霉素的新鮮培養基中，每孔細胞密度不超過25%，每隔2～3 d移除和更換含有嘌呤霉素的培養基，并進行細胞觀察，7 d后再次觀察GFP表達情況，并收集細胞進行下一步實驗。

1.4 GADD45α表達的檢測

① qRT-PCR檢測GADD45α的mRNA水平：收集處于對數生長期的各組細胞，PBS洗2～3次后加入TRIzol試劑1 ml裂解15 min，加入三氯甲烷1 ml，低溫下12 000 r/min 離心15 min，加入等體積的異丙醇混合后，靜置10 min，低溫下12 000 r/min離心15 min后取沉淀，紫外分光光度計下檢測RNA純度。合成引物由上海生工生物工程公司提供，序列引用先前實驗，GADD45α Forward:5′-GGGCGAATTCGGATC CGCCACCATGACTTTGGAGG-3′，Reverse:5′-TTGGA ATTCGCGGCCGCTCACCGTTCAGGGAGATTAAT-3′；GAPDH Forward:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG TAT-3′，Reverse:5′-AGCCTTCTCCAT-GGTGGTGAAG AC-3′。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，循環40次。② Western blot檢測細胞中GADD45α蛋白的表達：收集細胞后加入裂解液冰上裂解30 min，3 000 r/min離心30 min后收集上清液，并使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調整各組蛋白濃度后進行上樣，經過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白、PVDF轉膜、5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入GADD45α(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶10 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜處理3次后再加入辣根過氧化物酶HRP標記的二抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h，TBST再次洗膜處理3次，最后用ECL發光液中激發熒光，顯影并定影。分別計算出各組蛋白的相對表達量。

1.5 轉染后細胞增殖能力的CCK-8法檢測

采用CCK-8法檢測藥物對于各組細胞的半數抑制濃度IC。培養處于對數生長期的各組細胞，稀釋密度為2.0×10/ml，按100 μl/孔接種于96孔板，每組設置3個復孔，設置梯度濃度的IM干預，終濃度為0．0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L，培養24 h后，加入CCK-8試劑100 μl后繼續培養2 h，經過酶標儀檢測450 nm處的吸光度A。并計算IC。

1.6 轉染后細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測

加入10 μmol / L的IM處理K562和慢病毒載體處理后的K562IR，24 h收集細胞后加入Binding Buffer重懸。而后加入Annexin V-FITC混勻避光反應10 min，再加入PI染色避光反應10 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 轉染后細胞遷移能力的Transwell法檢測

取對數期的細胞加入Transwell小室，24孔板下室加入完全培養基和10 μmol/ L IM干預，待培養24 h后取出小室，棄去培養基，甲醇固定后用0.1%的結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞后鏡下觀察。

2 結果

2.1 GADD45α在K562和K562IR細胞中的表達情況

采用qRT-PCR和Western blot檢測K562和K562IR細胞中GADD45α的表達，結果顯示K562組細胞中的GADD45α蛋白和mRNA表達水平高于K562IR細胞(

P

<0.05)，結果見圖1。

圖1 qRT-PCR和Western blot法檢測K562和

2.2 轉染效率檢測

熒光圖片顯示(圖2)細胞熒光效率達85%以上。采用Western blot檢測轉染后實驗各組中GADD45α的表達，結果顯示Lv-GADD45α組細胞GADD45α蛋白表達水平上調，相比Lv-NC組差異有統計學意義(

P

<0.05) ,而Lv-GADD45α組和K562組比較差異無統計學意義，結果見圖3。

圖2 熒光顯微鏡下觀察Lv-NC組、Lv-GADD45α組細胞 ×200

圖3 Western blot檢測K562組、Lv-NC組、Lv-GADD45α組中GADD45α蛋白的表達

2.3 GADD45α基因上調后細胞增殖能力的變化

利用終濃度為0．0、 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L的IM干預K562、Lv-NC、Lv-GADD45α組后細胞存活率下降。3組的IC分別為10.08 μmol / L、50.56 μmol/L、18.72 μmol/L。從結果來看，Lv-GADD45α組的存活率低于Lv-NC組，結果見圖4。

圖4 CCK-8法檢測不同濃度IM處理的各組細胞存活率

2.4 GADD45α基因上調后細胞體外凋亡的變化

以10 μmol/L的IM為測試劑量，分別干預K562、Lv-NC、Lv-GADD45α組細胞，檢測在耐藥劑量下細胞凋亡的試驗結果。結果顯示，K562組和Lv-GADD45α組凋亡率與Lv-NC組相比差異有統計學意義(

P

<0.01，

F

=1.44、0.96，

t

=11.42、7.76)，結果見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測K562組、Lv-NC組、Lv-GADD45α組細胞凋亡率

2.5 GADD45α基因上調后遷移能力的變化

使用等劑量10.0 μmol/L的IM對各組細胞進行干預，通過Transwell遷移小室檢測各組細胞的遷移能力,觀察小室底膜上下室側附著的細胞，取6個視野進行觀察和拍照，同時進行細胞計數。結果顯示K562組和Lv-GADD45α組細胞穿過的數目低于Lv-NC組細胞，K562組和Lv-GADD45α組相對于Lv-NC細胞遷移能力下降(

P

<0.01，

F

=2.46、2.57，

t

=11.89、9.01)，結果見圖6。

圖6 Transwell法檢測K562組、Lv-NC組、Lv-GADD45α組的侵襲能力 結晶紫染色×100

3 討論

IM目前被認為是慢性階段CML患者的一線治療藥物，也是CML晚期快速緩解的首選藥物，盡管通常是短期緩解，然而，約有1/3的患者在接受IM治療時會產生對IM的耐藥性。而在后來出現的第二代TKl尼洛替尼(nilotinib)、達沙替尼(dasision)等雖然在治療過程中會比IM出現更低的初級耐藥和突變發生，但尚未轉化為長期的總體生存優勢。越來越多的證據表明，并非所有的IM耐藥都來自BCR-ABL激酶結構域突變,已有研究表明，血紅素加氧酶-1通過干擾哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路誘導自噬形成，導致CML發生IM耐藥。因此，研究這些非突變機制在CML耐藥中具有重要意義。

GADD45α是一種廣泛表達的核蛋白，與參與DNA修復、細胞周期調節、凋亡、衰老和自噬的細胞蛋白發生物理作用，并且它的缺失顯示了基因組的不穩定性和增加了對致癌物的敏感性，促進腫瘤的發生。GADD45α在維持造血干細胞基因組完整性方面的作用是至關重要的，而其作為血液惡性腫瘤的腫瘤抑制因子的作用模式，除了提供DNA修復和基因組穩定性外，誘導分化則是GADD45α在造血系統中的主要抗白血病作用。GADD45α的上調是多種化療藥物抗腫瘤活性的重要步驟，例如多西紫杉醇、姜黃素等，而GADD45α的沉默可能會削弱這些藥物的治療效果。該課題組前期研究表明，miR-362-5p是GADD45α反向調控的miRNA，其在K562IR中的表達高于K562細胞中的表達，當IM抑制BCR-ABL活性后可降低K562細胞中miR-362-5p的表達水平。因此，該研究推測在慢性粒細胞白血病中對IM的耐藥可能與GADD45α的表達有關。

該研究考察了K562和K562IR細胞中GADD45α的mRNA和蛋白的表達的情況，GADD45α在IM敏感的K562 細胞中高表達，高于K562IR細胞，這與之前的研究結果一致，提示GADD45α可能參與了細胞發生耐藥的過程。進一步通過慢病毒轉染的方法上調了耐藥細胞株中 GADD45α基因，并通過Western blot檢測細胞轉染效率，結果顯示相比對照組和Lv-NC組，Lv-GADD45α組中GADD45α的表達上調。同時為了進一步研究上調GADD45α對K562IR的影響，該研究通過不同濃度的IM對各分組細胞進行干預，檢測不同組細胞的存活率、凋亡率和侵襲能力，結果表明Lv-GADD45α細胞組的凋亡率增高，存活率和侵襲能力降低。結果顯示，GADD45α的低表達可能是慢性髓細胞白血病細胞K562產生耐藥的一種機制。

已有研究表明，在BCR-ABL轉化髓系祖細胞中，當GADD45α缺失時會高度激活p38MAPK、PI3K/AKT和STAT5信號通路，促進細胞的增殖和減少凋亡。因此，當GADD45α基因上調后，可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路降低了表達BCR/ABL的慢性髓系白血病細胞的耐藥性，具體的機制還需進一步研究。