miR-223-3p通過抑制VHL促進牙髓干細胞成骨分化的研究

陸蓓蓓，朱友明

人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是人牙髓組織中具有自我更新功能的多能細胞，可誘導分化為成骨細胞、神經(jīng)細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞。微小RNA(microRNA，miR) 是在真核生物中內(nèi)源性表達長度為18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA。有研究表明，miR-223-3p上調(diào)堿性磷酸酶(ALP)活性，擴增礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，上調(diào)牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 (DMP-1)的蛋白水平，促進DPSCs成牙本質(zhì)分化。低氧誘導因子-1α ( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 是HIF-1的活性單位，其調(diào)節(jié)數(shù)百個參與骨髓血管生成、血管反應和動脈血管生成的基因的轉(zhuǎn)錄活性。 HIF-1α和希佩爾林道(Von Hippel-Lindau，VHL)基因是腫瘤低氧反應的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤血管生成和腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用。目前尚無文獻報道HIF-1α、VHL與miR-223-3p表達的關(guān)系。在這項研究中檢測miR-223-3p在低氧誘導DPSCs細胞中的表達，研究其對牙髓干細胞增殖能力的影響，預測miR-223-3p的結(jié)合靶點，并研究其與miR-223-3p的關(guān)系，檢測VHL 及HIF-1α基因在DPSCs細胞中的表達，探究HIF-1α、VHL與miR-223-3p的表達在牙髓干細胞成骨分化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1

.

1

.

1

細胞來源 實驗牙髓干細胞來源于臨床收集年輕因正畸需要拔除的健康前磨牙或阻生齒。

1

.

1

.

2

主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，miR-223-3p模擬物(miR-223-3p mimics )、miR-223-3p抑制劑(miR-223-3p inhibitor)、亂序RNA(scrambled RNA)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，胎牛血清(美國HyClone公司)，RNA抽提試劑TRIzol(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 方法

1

.

2

.

1

細胞培養(yǎng) 在無菌條件下，劈開牙齒，取出牙髓并切成碎片。首先滴1滴培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中，用消過毒的鑷子把破碎的組織放入培養(yǎng)液。注意組織鋪平不要重疊。在蓋玻片的4角涂上無菌凡士林，輕輕地將蓋玻片蓋在組織上，使其貼壁生長；不要產(chǎn)生氣泡。將DPSCs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入鏈霉素和青霉素，在5% CO、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，細胞爬出，待細胞長到匯合度90%～95%時進行傳代。實驗所用牙髓干細胞為第2～4代。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，細胞傳代后，每3 d 換液1次。

1

.

2

.

2

低氧處理DPSCs細胞 DPSCs細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，低氧處理DPSCs細胞24 h(O濃度1%，CO濃度5%)。

1

.

2

.

3

MTT法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的DPSCs細胞，分為miR對照組和miR-223-3p mimics組，每孔1 800個細胞均勻接種于96孔板上，每孔加200 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)4個復孔，倒置顯微鏡觀察細胞。原則上細胞貼壁后，按時間梯度添加miR-223-3p mimics處理DPSCs細胞，加入20 μl MTT 溶液( MTT濃度為5 g/L) ，5% CO,37 ℃繼續(xù)孵育4 h 后吸走上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，搖床低速振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線圖。

1

.

2

.

4

qRT-PCR法測定目的基因miR-223-3p、VHL和HIF-1α以及成骨相關(guān)因子(Runx2、BMP2) 的mRNA 的表達 總RNA提取及cDNA合成：TRIzol法提取細胞總RNA，測濃度后，放在冰上待用。再進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR法檢測miR-223-3p、VHL和HIF-1α以及成骨相關(guān)因子(Runx2、BMP2) 的mRNA的相對表達水平，設(shè)計合成經(jīng)GenBank檢索的miR-223-3p、VHL、HIF-1α、Runx2、BMP2的引物。擴增條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)。反應結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產(chǎn)物，并在紫外燈下觀察電泳帶并拍照。

1

.

2

.

5

Western blot 法檢測HIF-1α 蛋白以及VHL蛋白的表達 收集細胞RIPA冰上裂解40 min(加入蛋白酶抑制劑)，每隔5 min，搖勻1次。于4 ℃、12 000 r /min 離心15 min。取上清液到新管中，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，加入等體積2×SDS蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮15 min。使用12%的SDS-聚丙稀酰胺凝膠，用濕式電轉(zhuǎn)移法把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。TBST 沖洗5次，每次8 min，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液孵育一抗，4 ℃過夜。一抗稀釋比例 β-actin 1 ∶500，HIF-1α 1 ∶200，VHL 1 ∶1 000。第2 天在室溫下孵育二抗1 h 后TBST 洗滌5次，每次8 min。二抗用TBST稀釋1 ∶5 000。配制新鮮HRP底物(A液和B液1 ∶1混合，避光)，在化學發(fā)光檢測儀上曝光檢測。β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 miR-223-3p在低氧誘導的DPSCs中的表達增多

低氧誘導DPSCs細胞24 h(O濃度1%，CO濃度5%)，并選擇常氧下培養(yǎng)24 h(O濃度21%，CO濃度5%)的DPSCs細胞作為Ctr組。24 h后提取細胞總RNA，收集蛋白。應用qRT-PCR 以及Western blot 方法檢測低氧誘導組與Ctr組的miR-223-3p mRNA 相對表達水平以及HIF-1α 蛋白的表達。結(jié)果表明低氧誘導組DPSCs細胞中miR-223-3p mRNA相對表達水平明顯高于Ctr組DPSCs細胞 (圖1A) ,差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。用Western blot 方法檢測2組DPSCs細胞HIF-1α蛋白表達水平。正常情況下，HIF-1α 蛋白在DPSCs細胞中的表達較低。低氧誘導DPSCs細胞24 h(O濃度1%，CO濃度5%)，HIF-1α 蛋白表達明顯增多(圖1B)。

圖1 miR-223-3p在低氧誘導的DPSCs中的表達

2.2 miR-223-3p靶向調(diào)控VHL

2

.

2

.

1

篩選miR-223-3p靶向作用的基因 通過生物信息學的方法，在targetscan 上對miR-223-3p的潛在結(jié)合位點進行預測，顯示miR-223-3p潛在靶向VHL 3′-UTR 146～152位之間的堿基(圖2) 。

圖2 miR-223-3p潛在靶向VHL 3′-UTR 146～152位之間的堿基

2

.

2

.

2

熒光報告基因驗證miR-223-3p靶向調(diào)控VHL 為進一步證明上述觀點，該實驗將野生型VHL(wt-VHL)與突變型VHL(mut-VHL)的3′UTR 區(qū)與雙熒光報道載體pmirGLO連接。將重組載體與miR-223-3p mimics或scramble RNA兩兩組合共轉(zhuǎn)染到hDPSCs細胞中，比較各組熒光信號的強弱。結(jié)果(圖3)顯示，mut- VHL和miR-223-3p mimics共轉(zhuǎn)染細胞后，細胞的熒光信號值與mut- VHL和scramble RNA共轉(zhuǎn)染組相比無明顯變化，而將wt- VHL和miR-223-3p mimics共轉(zhuǎn)染細胞后的熒光信號值與wt- VHL和scramble RNA共轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(

P

<0.05)。即與miR對照組相比，miR-223-3p顯著抑制了野生型報告基因的相對活性，但沒有抑制突變型報告基因的相對活性。

圖3 luciferase 實驗表明miR-223-3p靶向作用于VHL 與miR對照組比較：*P<0.05

2

.

2

.

3

細胞學驗證miR-223-3p靶向調(diào)控VHL 將miR-223-3p mimics在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染至DPSCs細胞，并選擇表達scramble RNA的DPSCs細胞作為miR對照組。轉(zhuǎn)染48 h后提取細胞總RNA和蛋白，用qRT-PCR檢測miR-223-3p mimics組及對照組DPSCs細胞中miR-223-3p、VHL的mRNA的表達情況。結(jié)果表明，與miR對照組相比，表達miR-223-3p mimics的DPSCs細胞中miR-223-3p的mRNA 表達水平發(fā)生上調(diào)(圖4A) ，VHL的mRNA 表達水平發(fā)生下調(diào)(圖4B) (

P

<0.05)。通過Western blot 方法檢測HIF-1α、VHL蛋白表達水平。結(jié)果表明，與miR對照組相比，表達miR-223-3p mimics的DPSCs細胞中HIF-1α蛋白的表達上調(diào)，VHL蛋白的表達下調(diào)(圖4C)(

P

<0.05)。

圖4 轉(zhuǎn)染后2組miR-223-3p和VHL的mRNA 及HIF-1α、VHL蛋白表達水平變化

用miR-223-3p inhibitor反向驗證miR-223-3p的作用，將miR-223-3p inhibitor在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染至DPSCs細胞，并選擇表達scramble RNA的DPSCs細胞作為miR對照組。轉(zhuǎn)染48 h后提取細胞總RNA和蛋白，用qRT-PCR檢測miR-223-3p inhibitor組及對照組DPSCs細胞中miR-223-3p、VHL的mRNA的表達情況。結(jié)果顯示，與miR對照組相比，表達miR-223-3p inhibitor的DPSCs細胞中miR-223-3p的mRNA 表達水平發(fā)生下調(diào)(圖5A) ，VHL的mRNA 表達水平發(fā)生上調(diào)(圖5B) (

P

<0.05)。通過Western blot 方法檢測HIF-1α、VHL蛋白表達水平。結(jié)果表明，與miR對照組相比，表達miR-223-3p inhibitor的存在顯著下調(diào)了HIF-1α蛋白的表達水平，顯著上調(diào)了VHL蛋白的表達(圖5C)(

P

<0.05)。

圖5 轉(zhuǎn)染后2組miR-223-3p和VHL的mRNA 及HIF-1α、VHL蛋白表達水平變化

2.3 miR-223-3p對細胞增殖的影響

將miR-223-3p mimics在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染至DPSCs細胞，并選擇表達scramble RNA的DPSCs細胞作為miR對照組。轉(zhuǎn)染0、12、24、48、72 h 后，通過MTT 實驗檢測miR對照組和miR-223-3p mimics組DPSCs細胞增殖能力。在培養(yǎng)DPSCs細胞72 h后，miR-223-3p mimics組較miR對照組細胞增殖能力則明顯升高(圖6)，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05) 。研究結(jié)果表明miR-223-3p可能促進DPSCs細胞增殖能力。

圖6 miR-223-3p對細胞增殖的影響與miR對照組比較：*P<0.05

2.4 miR-223-3p促進成骨相關(guān)因子(Runx2、BMP2) 的mRNA的表達

將miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染至DPSCs細胞，并選擇表達scramble RNA的DPSCs細胞作為miR對照組。分別于轉(zhuǎn)染0、1、4、7、14、21 d后檢測miR-223-3p、VHL、HIF-1α和2個與成骨密切相關(guān)的基因。與miR對照組相比，隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，自第4天起HIF-1α、Runx2和BMP2的mRNA表達顯著增高，至第21天仍維持高水平，而VHL mRNA的表達水平自第1天起顯著下降，之后一直維持著低水平(

P

<0.05)。以上結(jié)果顯示，miR-223-3p、HIF-1α、Runx2、BMP2的mRNA表達水平與轉(zhuǎn)染時間呈正相關(guān)，VHL的mRNA表達水平與轉(zhuǎn)染時間呈負相關(guān)。miR-223-3p促進成骨相關(guān)因子(HIF-1α、Runx2、BMP2) mRNA的表達。見圖7。

圖7 qRT-PCR分析目的基因轉(zhuǎn)染DPSCs后成骨相關(guān)基因和miR-223-3p、VHL、HIF-1α的表達

3 討論

HIF-1 是一種異源二聚體，由兩個亞基組成，即O調(diào)節(jié)的HIF-1α 亞基和組成性表達的HIF-1β 亞基。正常氧濃度下，HIF-1α合成和降解的動態(tài)平衡使HIF-1α保持在低濃度，而在低氧條件下，HIF-1α的降解被抑制并在細胞內(nèi)積累。HIF-1作為氧信號通路的核心，其生物活性可受到多種低氧誘導因子的調(diào)控，并影響其下游基因的轉(zhuǎn)錄?？梢栽谡麄€人類基因組的數(shù)千個位點形成活躍的轉(zhuǎn)錄復合物，激活適應低氧的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄，包括促紅細胞生成素(EPO)、VEGF 和糖酵解酶等，促進機體對低氧環(huán)境的適應。研究顯示在牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)中敲除VEGF可降低成骨相關(guān)基因RUNX2、堿性磷酸酶(ALP)和I型膠原(COL1)的表達，低氧可增強PDLSCs成骨早期ALP、COL1和骨鈣素(OCN)的表達。

VHL是一個編碼pVHL抑癌蛋白的抑癌基因，pVHL參與E3 泛素連接酶復合物(VCBC) 的組成，VCBC 由pVHL、延長蛋白B、C 和Cul2 蛋白等形成。常氧情況下，VCBC可直接和HIF-1α經(jīng)pVHL結(jié)合，泛素化修飾后被蛋白酶體降解。低氧環(huán)境中(或者細胞缺乏pVHL、)HIF-1α積聚在細胞核中并與HIF-1β形成HIF-1二聚體，HIF-1轉(zhuǎn)錄激活100～200個促進適應低氧環(huán)境的基因。有研究顯示，泛素偶聯(lián)酶E2S (ubiquitin-conjugating enzyme E2S，UBE2S)可通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和VHL/HIF-1α /STAT3途徑增強上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。Frost et al首次揭示了一種有效的選擇性化合物，一種名為VH298的VHL抑制劑，它為HIF靶向治療增加了一個新的維度。研究表明VH298通過抑制羥基化HIF-1泛素化途徑有效地激活HIF-1信號通路，顯著增加成纖維細胞增殖、血管生成和I型膠原- a2l1 (Col1- a2l1)、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGF-A)和胰島素樣生長因子1 (IGF-1)的基因表達。

有研究表明，miR-223-3p通過靶向SHOX2抑制口腔鱗癌的增殖和轉(zhuǎn)移。研究通過檢測50例口腔癌患者治療前后血清miR-223-3p的變化，顯示血清中miR-223-3p的相對表達水平在研究中低于對照組，治療后miR-223-3p表達明顯高于治療前。另有研究顯示，抑制miR-223-3p可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平顯著降低VEGFA的表達，過表達miR-223-3p可顯著提高VEGFR2的表達。

該實驗通過低氧誘導DPSCs細胞顯示miR-223-3p的mRNA 相對表達水平明顯高于Ctr組，推測miR-223-3p可能與HIF-1α的表達相關(guān)。通過生物信息學的方法預測miR-223-3p的潛在結(jié)合靶點，顯示miR-223-3p可能靶向VHL 3′-UTR 146～152位的之間的堿基。且經(jīng)luciferase 實驗表明，將miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染至DPSCs細胞中，顯示VHL的mRNA 表達水平下調(diào)，HIF-1α蛋白表達水平上調(diào)，VHL蛋白表達水平下調(diào)；而將miR-223-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至DPSCs細胞中，顯示VHL的mRNA 表達水平上調(diào)，HIF-1α蛋白的表達水平顯著下調(diào)， VHL蛋白表達水平上調(diào)。該研究表明miR-223-3p靶向VHL 3′-UTR，抑制HIF-1α 的降解使HIF-1α 在細胞內(nèi)過表達。將miR-223-3p mimics成功轉(zhuǎn)染后檢測miR-223-3p、VHL、HIF-1α和2個與成骨密切相關(guān)基因的表達情況。初步證實了體外miR-223-3p通過抑制VHL基因促進HIF-1α表達來促進牙髓干細胞成骨分化，體外實驗結(jié)果給體內(nèi)動物實驗的研究奠定了基礎(chǔ)。另有研究通過構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染DPSCs，結(jié)果顯示其中突變組可以在常氧條件下穩(wěn)定表達HIF-1α。在體外，HIF-1α通過促進VEGF的表達促進DPSCs血管向分化。