lncRNA PWAR5通過靶向miR-30a-5p/SOCS3分子軸降低心肌炎心肌細胞的損傷

盧英紅，遲偉峰，譚玉婷，王春筱，紀文巖，吳 賽

心肌炎是指心肌受累導致心肌細胞病變的炎癥性疾病，由多種病因如免疫損傷、細菌感染、病毒感染等引起。心肌炎可引起心律失常，導致心臟收縮和舒張功能障礙。心肌炎臨床表現為胸悶、心悸、心律不齊甚至心力衰竭等癥狀，嚴重者可導致患者心源性猝死。心肌炎的病理過程尚不完全明確，臨床治療主要是對癥治療。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類大于200個核苷酸的內源性非編碼RNA，廣泛存在于細胞質或細胞核中。lncRNA在轉錄水平、轉錄后水平以表觀遺傳的方式調控基因的表達，影響細胞分化、增殖、凋亡等功能。研究表明，lncRNA的異常表達與各種心臟疾病的發生和發展相關。近年來PWAR5是lncRNA研究的熱點，其在甲狀腺癌、膠質瘤中發揮的抑癌基因作用。PWAR5在心臟疾病特別是心肌炎中的功能及作用機制尚不明確。該研究旨在觀察PWAR5在脂多糖誘導心肌炎時對大鼠原代心肌細胞的保護作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

空載慢病毒(含綠色熒光蛋白GFP)、載有PWAR5序列的慢病毒(含綠色熒光蛋白GFP)、miR-30a-5p、miR-NC、PWAR5熒光報告載體(野生型WT和突變型MT)購自上海碧云天生物科技有限公司。用于解離原代心肌細胞的3 d新生SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司。293T細胞購自中國典型培養物保藏中心。MTS試劑盒、ELISA試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司。轉染試劑Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司。DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京威格拉斯生物技術有限公司。膠原酶Ⅰ購自美國Sigma公司。一抗和二抗購自美國BD公司。

1.2 細胞解離、培養及分組

采用膠原酶Ⅰ將大鼠心臟組織解離成單細胞懸液，在37 ℃、5% CO條件下，采用含20%胎牛血清的DMEM培養基培養。分別載有PWAR5序列的慢病毒和空載慢病毒，定義為PWAR5組和Control組，24 h后在熒光顯微鏡下拍照。每組分別滴加100 μl脂多糖(濃度為10 μmol/L)，孵育24 h進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR檢測PWAR5、miR-30a-5p和SOCS3 mRNA的表達

每組細胞加入TRIzol提取總RNA，逆轉錄為cDNA后，配制qRT-PCR反應體系。PWAR5和SOCS3 mRNA的相對表達以α-Tubulin為內參，miR-30a-5p的相對表達以U6為內參。引物序列如下，miR-30a-5p正向引物：ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC，反向引物：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；U6正向引物：CGCGCTTCGGCAGCACATATACT，反向引物：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。α-Tubulin正向引物：CCAAGCTGGAGTTCTCTA，反向引物：CAATCAGAGTGCTCCAGG；PWAR5正向引物：TGATGTGGGTGTTGATAC，反向引物：ACTCAAAGGCAAGAACTA；SOCS3正向引物：CCTGCGCCTCAAGACCTTC，反向引物：GTCACTGCGCTCCAGTAGAA。反應參數：95 ℃預變性6 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40個循環，采用2法計算PWAR5、miR-30a-5p和SOCS3 mRNA的相對表達。

1.4 MTS法檢測大鼠原代心肌細胞活力

將脂多糖處理的大鼠原代心肌細胞接種于96孔板，每孔2×10個細胞。24 h后，避光條件下加20 μl/孔 MTS溶液，培養箱內培養3 h。通過酶標儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，代表各組大鼠原代心肌細胞的活力。

1.5 ELISA法檢測上清液中白細胞介素(interleukin，IL)-1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNF)-α的含量

收集脂多糖處理后的各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，通過酶標儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，比較各組上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡比例

消化、離心收集脂多糖處理后的大鼠原代心肌細胞，采用緩沖液進行重懸。每組取100 μl細胞懸液至流式管，分別加Annexin V-FITC溶液和PI溶液各5 μl，充分混勻后在冰箱內靜置20 min。上機前，每管加100 μl緩沖液，采用流式細胞儀檢測每組細胞的凋亡比例。

1.7 生物信息學方法預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證PWAR5的靶基因

采用starBase V 3.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測PWAR5結合的微小(miRNA)。將PWAR5-WT和PWAR5-MT熒光報告載體分別與miR-NC或miR-30a-5p共轉染293T細胞，48 h后通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲螢光素酶活性和海參螢光素酶活性，相對螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海參螢光素酶活性值。

1.8 Western blot法檢測SOCS3蛋白及凋亡相關蛋白表達

胰酶消化各組大鼠原代心肌細胞，細胞裂解液裂解細胞，離心提取總蛋白。加入上樣緩沖液，100 ℃水浴8 min，進行十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至硝酸纖維素膜。采用5%脫脂牛奶封閉3 h，與一抗在4 ℃冰箱孵育過夜。加入二抗孵育3 h，滴加ECL化學發光試劑，通過凝膠成像系統觀察蛋白條帶。

2 結果

2.1 兩組大鼠原代心肌細胞中PWAR5的相對表達水平

熒光顯微鏡顯示，Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細胞均表達綠色熒光蛋白，表明細胞慢病毒感染成功。見圖1。

圖1 Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細胞綠色熒光蛋白表達 ×100

qRT-PCR結果顯示，Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細胞中PWAR5相對表達分別為(1.03 ± 0.15)和(9.71 ± 1.20)，PWAR5組PWAR5相對表達高于Control組(

t

=7.199，

P

<0.01)。見圖2。

圖2 Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細胞中PWAR5的相對表達與Control組比較：**P<0.01

2.2 高表達PWAR5對大鼠原代心肌細胞活力的影響

MTS法結果顯示，脂多糖處理后的Control組和PWAR5組大鼠原代心肌細胞活力分別為(1.02 ± 0.10)和(5.35 ± 0.48)，與Control組相比，PWAR5組大鼠原代心肌細胞的活力增加(

t

=8.795，

P

<0.01)。

2.3 高表達PWAR5對上清液IL-1β和TNF-α含量的影響

ELISA法結果顯示，脂多糖處理后的Control組和PWAR5組上清液中IL-1β含量分別為(25.13 ± 2.03)pg/ml和(10.28 ± 1.68)pg/ml，差異有統計學意義(

t

=5.631，

P

<0.01)；Control組和PWAR5組上清液中TNF-α含量分別為(32.26 ± 3.71)pg/ml和(14.26 ± 1.95)pg/ml，差異有統計學意義(

t

=4.297，

P

<0.01)；與Control組相比，PWAR5組上清液中IL-1β和TNF-α含量均下降。

2.4 高表達PWAR5對大鼠原代心肌細胞凋亡比例的影響

流式細胞術顯示(圖3)，脂多糖處理24 h后，PWAR5組和Control組大鼠原代心肌細胞凋亡比例分別為(12.61 ± 2.05)%和(29.25 ± 2.46)%，與Control組相比，高表達PWAR5抑制大鼠原代心肌細胞的凋亡，差異有統計學意義(

t

=5.191，

P

<0.01)。

圖3 流式細胞術檢測PWAR5對大鼠原代心肌細胞凋亡比例的影響與Control組比較：**P<0.01

2.5 生物信息學方法預測PWAR5的靶基因

采用生物信息學軟件starBase V 3.0預測PWAR5可靶向結合miR-30a-5p。見圖4。

圖4 生物信息學方法預測PWAR5的靶基因

2.6 PWAR5與miR-30a-5p的靶向關系

雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，PWAR5-WT/miR-NC組、PWAR5-WT/miR-30a-5p組、PWAR5-MT/miR-NC組和PWAR5-MT/miR-30a-5p組的相對熒光素酶活性分別為(1.03 ± 0.12)、(0.33 ± 0.05)、(0.96 ± 0.04)和(0.99 ± 0.10)，PWAR5-WT/miR-30a-5p組較PWAR5-WT/miR-NC組降低(

t

=5.350，

P

<0.01)。結果顯示PWAR5與miR-30a-5p之間可靶向結合。見圖5。

圖5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證PWAR5與miR-30a-5p的靶向關系與miR-NC組比較：**P<0.01

2.7 高表達PWAR5對大鼠原代心肌細胞中miR-30a-5p和SOCS3 mRNA表達的影響

qRT-PCR結果顯示，PWAR5組和Control組大鼠原代心肌細胞miR-30a-5p的表達分別為(0.29 ± 0.05)和(1.02 ± 0.12)，高表達PWAR5可抑制miR-30a-5p的表達(

t

=5.80，

P

<0.01)。PWAR5組和Control組大鼠原代心肌細胞SOCS3 mRNA的表達分別為(5.82 ± 0.79)和(1.05 ± 0.08)，高表達PWAR5可促進SOCS3 mRNA的表達(

t

=6.081，

P

<0.01)。

2.8 高表達PWAR5對SOCS3蛋白和凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與Control組相比，PWAR5組大鼠原代心肌細胞中SOCS3蛋白的表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達上升，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達降低。見圖6。

圖6 Western blot法檢測SOCS3蛋白和凋亡相關蛋白的表達

3 討論

心肌炎誘發炎性滲出，導致心肌細胞的耗氧量增加，心肌細胞的活力下降，心肌細胞凋亡比例增加。心肌炎的發病機制復雜，組織病理學及免疫組織化學是目前心肌炎的主要診斷方式。尋找新的分子靶點對心肌炎的診斷、治療及預后具有重要臨床意義。lncRNA廣泛參與調控各種心血管疾病的發生、發展。Cao et al報道，lncRNA HIF1A-AS1在柯薩奇病毒B3誘導的心肌炎中表達上升，下調lncRNA HIF1A-AS1表達可有效抑制心肌細胞的凋亡，miR-138是lncRNA HIF1A-AS1的靶基因。Zhang et al報道，lncRNA ROR通過影響C-Myc蛋白的表達，促進病毒性心肌炎大鼠心肌的纖維化。研究表明，PWAR5在膠質瘤、甲狀腺癌中發揮抑癌基因作用，可抑制腫瘤的增殖和進展，與腫瘤患者的預后密切相關。PWAR5對心肌炎時心肌細胞的作用及分子機制并不明確。

該研究結果顯示，脂多糖處理后，過表達PWAR5可抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的滲出，降低炎癥反應。同時，PWAR5可增強大鼠原代心肌細胞的活力，抑制心肌細胞的凋亡，降低心肌細胞的損傷。lncRNA發揮作用的主要方式是“海綿作用”，即互補結合miRNA，降低miRNA對其下游靶基因的干擾作用，從而上調miRNA下游靶基因的表達。該研究通過starBase V 3.0預測顯示，PWAR5可能互補結合的miRNA是miR-30a-5p。雙熒光素酶報告基因檢測進一步表明，PWAR5可互補結合miR-30a-5p。研究顯示，急性病毒性心肌炎患者血清外泌體中miR-30a-5p的含量增加，miR-30a-5p通過靶向干擾細胞因子信號傳導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)促進心肌炎癥反應的發生，誘導心肌細胞的不可逆損傷。SOCS3基因位于染色體17q25.3，SOCS3蛋白在細胞因子信號通路中發揮負反饋調控作用，可抑制心肌炎的進展。該研究結果顯示，上調PWAR5表達后，大鼠原代心肌細胞中miR-30a-5p表達下降，SOCS3 mRNA表達增加，表明PWAR5可通過靶向結合miR-30a-5p上調SOCS3 mRNA的表達。Western blot檢測進一步顯示，與Control組相比，高表達PWAR5后，SOCS3、Bcl-2蛋白表達上調，Bax、Caspase-3蛋白表達下調，表明PWAR5可抑制大鼠原代心肌細胞的凋亡。

綜上所述，PWAR5可有效降低脂多糖誘導的炎癥反應，增強大鼠原代心肌細胞的活力并抑制其凋亡，其分子機制是PWAR5通過靶向結合miR-30a-5p上調SOCS3基因的表達。該研究表明PWAR5在心肌炎心肌細胞中發揮保護作用，可能為心肌炎的靶向治療提供了新的思路。