肝細胞癌患者TIM-3+ TIGIT+CD4+ T細胞和TIM-3+TIGIT+CD8+ T細胞免疫耗竭及其與疾病進展的關系

袁潤林,鄭美娟，陳正徐，徐元宏

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作為世界范圍內常見的惡性腫瘤，臨床醫師對晚期肝癌的治療面臨著巨大挑戰。許多惡性腫瘤的治療選擇靶向免疫檢查點抑制劑。T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(TIGIT)是T細胞或NK細胞抑制性受體，T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)是一種免疫負性調控因子，程序性死亡受體1(PD-1)是一種常見的免疫抑制受體。CD4和CD8調節性T淋巴細胞參與腫瘤微環境中的免疫抑制，在腫瘤微環境中,CD8和CD4T細胞等免疫細胞通常伴隨著細胞表面異常表達的抑制性受體譜系。而且，針對單個免疫檢查點的單克隆抗體在HCC患者的治療中應答率較低。

該研究通過檢測HCC患者外周血CD4T細胞、CD8T細胞中PD-1、TIM-3、TIGIT和白介素(interleukin，IL)-10的表達，探討免疫檢查點的表達狀態與HCC進展、預后的關系，進而為逆轉免疫細胞耗竭及HCC的臨床治療提供目標靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

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病例資料 收集安徽醫科大學第一附屬醫院 2019年10月—2020年11月30例HCC患者臨床資料。健康對照組(health controls，HC) 根據患者的依從性和年齡選擇20例健康人；所有HCC患者診斷均符合《原發性肝癌診斷標準》，所有健康者排除患腫瘤、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎。

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試劑與儀器 抗體PE-PD-1、BV421-TIM-3、APC-H7-CD8、BV421-IL-10、BV510-CD3均購自美國 BD 公司；抗體APC-TIGIT購自美國Biolegend公司；紅細胞裂解液、CBA Human Th1 / Th2 Cytokine Kit(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-gamma) 購自美國BD公司；細胞固定液和穿膜液購自美國賽默飛公司；Ficoll液購自天津TBD公司；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)、莫能霉素(MON) 購自美國Sigma-Aldrich公司；離子霉素(ION) 購自美國Merck Millipore公司。FACS CANTO Ⅱ PLUS 型流式細胞儀購自美國BD公司；DXH800全自動血液分析儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

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標本采集 分別采集HCC患者和健康體檢者外周血，置于血清管和EDTA抗凝管；EDTA抗凝血用于流式細胞術檢測PD-1CD4T細胞、TIM-3CD4T細胞、TIGITCD4T細胞、PD-1CD8T細胞、TIM-3CD8T細胞、TIGITCD8T細胞和IL-10CD4T細胞的比例，全自動血液分析儀進行白細胞計數與分類；血清用于 Th1 / Th2細胞因子檢測。

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分離單個核細胞(PBMC) 準備15 ml離心管1支，同時加入2 ml Ficoll液，將2 ml PBS加入患者和健康人2 ml抗凝全血中進行1 ∶1稀釋。然后將稀釋后的全血緩慢加在Ficoll液面，注意沿管壁進行緩慢加樣，保持兩液面清晰，不要讓血液混入至分層液內。然后置于離心機中1 900 r/min配平離心30 min后，用吸管將白膜層細胞緩慢吸至流式試管中，即為外周血分離PBMC。

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3

PD-1CD4T細胞、TIM-3CD4T細胞、TIGITCD4T細胞、PD-1CD8T細胞、TIM-3CD8T細胞、TIGITCD8T細胞的檢測 分離1×10PBMC后；在流式管中用加樣槍分別加入相應抗體BV510-CD3、APC-H7-CD8、PE-PD-1、APC-TIGIT、BV421-TIM-3各10 μl并混勻，將流式管室溫及避光條件下孵育20 min，然后加入2 ml PBS 1 800 r/min 離心5 min，棄上清液，200 μl PBS重懸細胞沉淀，BD流式細胞儀上機檢測，采用Flowjo軟件分析檢測結果。

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4

IL-10CD4T細胞的檢測 分離 PBMC后，將含10% FBS的DMEM 培養基、PMA，MON及ION按照比例配置成內標刺激液，在細胞中加入1 ml培養基，混勻之后放入溫箱內孵育4 h，然后離心、棄上清液，PBS洗滌1次，分別加入相應抗體BV510-CD3、APC-H7-CD8并混勻，置于4 ℃冰箱內避光孵育30 min，加入100 μl固定液4 ℃冰箱避光孵育40 min后加入1 ml穿膜液破膜，PBS洗滌棄上清液后分別加入BV421-IL-10抗體10 μl，混勻后放入4 ℃冰箱內孵育60 min。然后加入1 ml PBS 1 800 r/min離心5 min，棄上清液，300 μl PBS重懸細胞沉淀， BD流式細胞儀上機檢測，采用Flowjo軟件分析檢測結果。

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CBA技術用于檢測Th1 /Th2 細胞因子 準備標準品，采用倍比稀釋方法，將9個試管分別標記為原液，1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128和1 ∶256；除原液管外，每根管子內加入50 μl稀釋液，再依次轉移50 μl至下一管內，完成梯度稀釋；然后根據實驗的樣本和標準曲線的數量確定配置 Mixbeads所需量，配好的Mixbeads 3 500 r/min離心5 min，倒去上清液，并加入體積相同的Serum Enhancement Buffer液，混勻后避光孵育30 min；取新流式管編號，在每管中依次加入50 μl Mixbeads、50 μl抗體B液、50 μl標本血清或配備的標準品，振蕩混勻，避光孵育3 h，然后每管中加1 ml PBS 1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μl PBS重懸，BD流式細胞儀上機檢測，細胞因子濃度采用DIVA 軟件和OriginPro軟件分析。

2 結果

2.1 病例資料

30例HCC患者中男性20例，女性10例，年齡37～70(55.2±7.6)歲。20例健康對照組(HC組)中男性13例，女性7例，年齡35～66(51.8±7.1)歲。HCC組與健康對照組性別、年齡比較差異無統計學意義。

2.2 HCC患者外周血中CD4

T細胞相關表型表達比例的檢測

采用流式細胞術檢測外周血PBMC中CD4T細胞，HCC患者組外周血TIM-3CD4T細胞、TIGITCD4T細胞、PD-1CD4T細胞、TIM-3TIGITCD4T細胞比例高于健康對照組，差異有統計學意義(

P

<0.001,

t

=4.042、3.533、3.867、4.327)，見圖1A、B、C。進一步檢測PD-1在HCC患者組外周血TIM-3TIGITCD4T細胞和TIM-3TIGITCD4T細胞兩組中的表達，研究表明PD-1TIM-3TIGITCD4T細胞比例高于PD-1TIM-3TIGITCD4T細胞比例，差異有統計學意義(

P

<0.001,

t

=5.106)，統計圖見圖1D。

圖1 HCC患者及健康對照者外周血CD4+ T細胞表型檢測

2.3 HCC患者外周血中CD8

T細胞相關表型表達比例的檢測

采用流式細胞術檢測外周血PBMC中CD8T細胞，HCC患者組外周血TIM-3CD8T細胞、TIGITCD8T細胞、PD-1CD8T細胞比例高于健康對照組，差異有統計學意義(

P

<0.01,

t

=3.346、2.782、2.938)。此外，該研究進一步檢測患者組TIM-3TIGITCD8T細胞比例明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(

P

<0.001,

t

=3.852)。見圖2A、B、C。進一步檢測PD-1在HCC患者組外周血TIM-3TIGITCD8T細胞和TIM-3TIGITCD8T細胞兩組中的表達，研究表明PD-1TIM-3TIGITCD8T細胞比例高于PD-1TIM-3TIGITCD8T細胞比例，差異有統計學意義(

P

<0.001,

t

=4.642)，見圖2D。

圖2 HCC患者及健康對照者外周血CD8+ T細胞表型檢測

2.4 HCC患者外周血中TIM-3

TIGIT

CD8

T細胞比例與TIM-3

TIGIT

CD4

T細胞比例的ROC曲線分析

利用 ROC曲線分析外周血中TIM-3TIGITCD8T細胞比例與TIM-3TIGITCD4T細胞比例在HCC的診斷價值，該研究表明TIM-3TIGITCD8T細胞比例在HCC的診斷效能(AUC=0.915,cutoff value=1.95%, 95%

CI

: 0.839～ 0.991)均大于TIM-3CD8T細胞比例(AUC=0.796)和TIGITCD8T細胞比例(AUC=0.772)，見圖3A。同時，TIM-3TIGITCD4T細胞比例在HCC的診斷效能(AUC=0.950,cutoff value=1.05%, 95%

CI

: 0.897～1.004)均大于TIM-3CD4T細胞比例(AUC=0.835)和TIGITCD4T細胞比例(AUC=0.780)，見圖3B。

圖3 HCC患者外周血中CD8+ T細胞與 CD4+ T細胞高表達抑制性受體的ROC曲線分析

2.5 比較HCC患者及健康對照者外周血IL-10

CD4

T細胞表達的百分比及血清IL-10含量

HCC患者組外周血IL-10CD4T細胞在患者外周血中表達比例明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(

P

<0.001,

t

=4.579)，見圖4A。此外，該實驗檢測患者組血清IL-10含量也高于健康對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05,

t

=2.046)，見圖4B。

圖4 HCC 患者及健康對照者外周血IL-10+ CD4+ T細胞的百分比及血清IL-10含量檢測

2.6 TIM-3

TIGIT

CD8

T細胞、TIM-3

TIGIT

CD4

T細胞比例高低兩組HCC患者中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)的比較

依據HCC中TIM-3TIGITCD8T細胞比例cutoff value=1.95%，將HCC患者分為高TIM-3TIGITCD8T細胞比例組和低TIM-3TIGITCD8T細胞比例組，比較兩組患者NLR，高TIM-3TIGITCD8T細胞比例組NLR結果高于低TIM-3TIGITCD8T細胞比例組，差異有統計學意義(

P

<0.05,

t

=2.593)，見圖5A。同時，依據HCC中TIM-3TIGITCD4T細胞比例cutoff value=1.05%，將HCC患者分為高TIM-3TIGITCD4T細胞比例組和低TIM-3TIGITCD4T細胞比例組，比較兩組患者NLR，研究結果表明高TIM-3TIGITCD4T細胞比例組NLR結果高于低TIM-3TIGITCD4T細胞比例組，差異有統計學意義(

P

<0.05,

t

=2.054)，見圖5B。

圖5 比較TIM-3+ TIGIT+ CD8+ T細胞比例高低兩組以及TIM-3+ TIGIT+ CD4+ T細胞比例高低兩組HCC患者NLR

3 討論

淋巴細胞免疫耗竭現象普遍存在于腫瘤及慢性感染中，其不利于免疫系統對腫瘤細胞殺傷以及病毒感染的清除。在腫瘤及慢性感染中，T細胞及NK細胞逐漸失去效應功能，并且普遍高表達抑制性受體。已有研究表明免疫細胞表達多種共刺激、共抑制性受體和其相應的配體相結合后，通過對細胞的刺激信號促進細胞活化，或抑制信號削弱免疫細胞的功能，抑制抗腫瘤反應，通過阻礙腫瘤清除來促進癌癥免疫逃逸。免疫耗竭的細胞會出現多種抑制性受體持續高表達，抑制性受體在慢性病毒感染和腫瘤微環境中發揮其作用，如： PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3及 TIGIT等。TIGIT屬于脊髓灰質炎病毒受體家族，在淋巴細胞表達，在效應和調節性CD4T細胞、濾泡輔助CD4T細胞、效應CD8T細胞和NK細胞中高表達。該研究TIGIT在HCC患者外周血中CD4T細胞、CD8T細胞表達比例均高于健康對照組，提示TIGIT與T細胞耗竭有關，阻斷TIGIT可防止T細胞衰竭并促進T細胞依賴性腫瘤免疫。Zhou et al研究表明從HCC組織分離的CD8和CD4T細胞上的TIM3、LAG3和CTLA4的表達明顯高于無腫瘤組織或外周血。該研究表明HCC患者組外周血中TIM-3在CD4T細胞、CD8T細胞的表達比例也均高于健康對照組。

TIM-3TIGITCD8T細胞和TIM-3TIGITCD4T細胞在HCC患者外周血中的表達比例上調，這與Liu et al報道的結果相似，該研究進一步表明PD-1在HCC患者組外周血TIM-3TIGITCD8T細胞和TIM-3TIGITCD4T細胞兩組中高表達，同時HCC的ROC效能分析顯示TIM-3TIGITCD8T細胞、TIM-3TIGITCD4T細胞比例曲線下面積均高于單一抑制性受體，可見，相較于單一抑制性受體，兩種抑制性受體共表達的水平對HCC的診斷更具有價值，此外，該研究表明HCC患者組外周血PD-1CD4T細胞、PD-1CD8T細胞比例高于健康對照組；PD-1與HCC的發生及演進有關，外周淋巴細胞PD-1的表達可作為HCC監測的分子標志；提示免疫細胞衰竭的程度與抑制性受體在細胞上的表達有關，2個或2個以上抑制性受體的共同表達比單一抑制性受體的高表達更能代表免疫細胞衰竭的狀態。

病毒慢性感染和腫瘤發生時，抑炎因子IL-10 通過促進T細胞耗竭與維持病毒長期存活發揮重要作用。有研究報道IL-10在HCC組織中的表達增加，因為Th1類細胞因子在機體抗腫瘤免疫中發揮非常重要的作用，而IL-10升高抑制了Th1細胞功能，所以IL-10升高能夠促進HCC的發生發展。該研究顯示HCC患者組外周血中IL-10CD4T細胞比例高于健康對照組，此外，患者組血清IL-10 含量也高于健康對照組，進一步證實IL-10在HCC免疫逃逸中起重要作用。

有研究表明NLR可以反映促進腫瘤的炎癥反應和抗腫瘤的炎癥反應之間的平衡，NLR水平與HCC患者的預后有一定的相關性，NLR值越高，預后越差。該研究結果顯示高值組NLR均高于低值組，提示TIM-3TIGITCD8T細胞、TIM-3TIGITCD4T細胞與HCC疾病進展加快和不良預后有關，這可能不僅對預后具有重要的臨床意義，而且還為免疫治療中的新靶點提供了理論依據。

綜上所述，免疫耗竭現象普遍存在于腫瘤微環境中，HCC患者外周血中普遍高表達抑制性受體，同時存在幾種抑制性受體共表達。而且，相較于單一抑制性受體，兩種抑制性受體共表達水平對HCC的診斷更具有價值，高TIM-3TIGITCD4T細胞表達及TIM-3TIGITCD8T細胞表達與HCC疾病進展加快和不良預后有關。針對于單分子靶向治療較低反應率、雙分子或多分子靶向治療可能會具有更大的臨床意義。該研究通過分析HCC患者外周血中T細胞表面高表達抑制性受體及其相關性研究可能為臨床治療提供了更多、更新穎的靶點，可能在腫瘤患者的免疫檢查點阻斷治療中發揮作用。