阪崎腸桿菌單克隆抗體的制備及其免疫檢測

◎ 向雙林，曾子安，楊開懷，禹 梁，李 樂，付舒翔，鄧燦平，丁 劍

（1.食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410111；2.湖南遠泰生物技術有限公司，湖南 長沙 410013）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）又被稱為克羅諾桿菌，是一種多分布于嬰幼兒食品及沖調谷物制品、能在食品表面形成生物膜的革蘭氏陰性致病菌[1-2]。有遺傳特異性的坂崎腸桿菌易使患者產生耐藥性，引起免疫力低下的嬰幼兒及老年人受到侵襲性感染，如嬰兒壞死性小腸結腸炎、腦膜炎和尿毒癥等[3-4]。因其對干燥和極端溫度顯著耐受，蟑螂、蒼蠅等都是其潛在的污染源，使得來自設備或生產環境的坂崎腸桿菌病原體成為嬰幼兒配方奶粉及其他加工食品生產中的安全隱患[4]。2018年湖南省銷售的嬰幼兒食品中阪崎腸桿菌檢出率為3.98%[5]。2012年和2019年天津市嬰幼兒食品和沖調谷物制品中阪崎腸桿菌檢出率分別為3.20%、39.80%[6]。2018—2019年貴州省銷售的嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的污染率達6.00%[7]。各地嬰幼兒食品中均存在不同程度的坂崎腸桿菌污染，因此對阪崎腸桿菌進行檢測至關重要。

國家標準、行業標準采用逐步篩選培養的傳統生化方法鑒定阪崎腸桿菌，但煩瑣的操作影響檢測效率且易產生與標準值的偏離[8]。API20E等生化自動化檢測系統又受限于數據庫從而影響結果準確性[9]。依賴于特異性靶點的普通PCR檢測阪崎腸桿菌屬的方法提高了檢測速度但存在漏檢及假陽性問題[10]。用基于抗原-抗體特異性、可逆性的免疫測定法鑒別研究細菌已有50多年，而抗體包被的磁珠有強靶向特異性，能快速富集、分離克羅諾桿菌[11]，以靶向性的抗原抗體與敏感的酶促反應來提高檢測靈敏性的酶聯免疫吸附法可不對食品進行分離提取而直接檢測阪崎腸桿菌[12]，因此高純度的單克隆抗體對ELISA檢測體系的建立尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8周齡BALB/c小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）；阪崎腸桿菌（ATCC）；SP2/0小鼠骨髓瘤細胞（美國Promab）；引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）；PCR試劑（日本takara）；費氏完全及不完全佐劑，HT、HAT培養基，4%臺盼藍，融合劑PEG，DMEM，DMSO（德國Sigma）；TMB（聯科生物技術）；substrate FBS血清（美國Gibco）；mAb亞類檢測試劑盒，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗IgG（武漢博士德）。

1.2 儀器與設備

純水儀（美國Millipore）；酶標儀，離心機（美國Thermo）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術）；二氧化碳培養箱（賽默飛世爾科技）；恒溫培養箱（上海浦東榮豐可續儀器）；細胞計數板（上海天光儀器廠）；冰箱（中國海爾）；PCR儀（瑞士Roche）；電泳儀（北京六一）；電泳成像系統（美國Bio-rad）。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗原的制備及鑒定

（1）抗原的制備。阪崎腸桿菌于無菌營養肉湯搖床上 37 ℃ 180 r·min-1振蕩培養 24 h 后，3 000 r·min-1離心10 min收集菌體，用平板計數法進行活菌計數。所得菌體用1.5%福爾馬林滅活16 h，再用無菌的生理鹽水洗滌2次并稀釋至1.0×1010CFU·mL-1作為免疫原，于-20 ℃保存備用。

（2）對阪崎腸桿菌進行菌種鑒定。從原始菌種中吸取1 mL菌液接種于10 mL無菌營養肉湯培養基中，36 ℃培養24 h。取1～2 μL菌液稀釋100倍，沸水浴20 min后取1 μL煮沸的菌液上清液為模板。根據阪崎腸桿菌（GenBank：AB004746）的16S rRNA基因和外膜蛋白A基因（ompA）序列分別設計兩對特異性引物。①16S-F：GGTAGCTAATACCGCA；16S-R：TTAGCTCCGGAAGCC（702 bp）。② 16S-F：GCATGGCTGTCGTCA；16S-R：ATGAATCACAAAGTGG（450 bp）。 ③ ompA-F：GGATTTAACCGTGAACTTTTCC；ompA-R：CGCCAGCGATGTTAGAAGA（469 bp）。④ompA-F：TGAAAGCAATCGACAAGAAG；ompA-R：ACTCATTACCCCTCCTGATG（1 680 bp）。然后進行PCR擴增，實時熒光PCR反應體系包括：2 μL 10×Buffer，1.6 μL dNTP，上下游引物各 0.5 μL，模板 DNA 1 μL，Taq-酶 0.2 μL，補 dd H2O 至 20 μL。設置反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；72 ℃ 8 min，35個循環。反應后取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 免疫動物及方法

首次免疫取0.25 mL的0.2 CFU·mL-1菌液與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下或肌肉注射法免疫BALB/c小鼠1#、2#、3#、4#和5#號，每只共注射0.5 mL。3周后，取0.25 mL的0.1 CFU·mL-1菌液與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，注射部位及劑量同上。以2周為周期進行第3次及第4次免疫。4次免疫后10 d進行尾靜脈采血。采集的小鼠血清作為待檢測血清，免疫前的小鼠血清作為陰性血清用間接ELISA法進行滴度檢測。

1.3.3 細胞融合

選擇渾圓、透亮、均一、排列整齊且處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞進行傳代培養，為避免細胞返祖使用8-AG定期處理細胞。對3#號已免疫小鼠進行眼球采血并分離血清為陽性血清于-20 ℃保存。將免疫小鼠脊椎脫臼致死后取脾臟于DMEM液中碾磨收集脾細胞。骨髓瘤細胞與脾細胞以1∶3比例1 500 r·min-1混合5 min。用PEG融合，37 ℃溫水中搖動混勻。在96孔板中鋪入200 μL上述融合細胞并加入含HAT的培養基進行融合細胞的篩選，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。

1.3.4 雜交瘤細胞陽性篩選及克隆化

將制備完成的小鼠飼養細胞鋪于96孔細胞培養板中，至100 μL/孔后將要克隆的陽性孔中的雜交瘤細胞輕輕吹散后計數，將細胞用HT培養基稀釋至100 μL/孔，每孔中含1個細胞。9 d后待測細胞約鋪滿33%孔底，用間接ELISA法對細胞上清液進行效價測定。檢測后選擇抗體效價較高、細胞生長狀態好、呈單集落生長的陽性孔進行亞克隆，再次克隆仍選用HT培養基進行篩選，一次克隆且陽性率達到100%即認為是穩定分泌抗體的單克隆細胞。每次克隆的原孔中的細胞全部轉移至24孔板內培養并凍存，將經過有限稀釋法3次亞克隆且陽性率達到100%的雜交瘤細胞轉移入6孔細胞培養板中培養。

1.3.5 單克隆抗體的制備及純化

選取8周齡的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5 mL，7～10 d后每只小鼠腹腔注射雜交瘤細胞5×105個。15 d后待小鼠腹部明顯鼓脹時收集腹水以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化后，使用間接酶聯免疫吸附試驗檢測單克隆抗體效價，用紫外吸收法測定抗體濃度，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）檢測抗體純度。用Sigma公司生產的抗體亞型檢測試劑盒鑒定抗體亞型，用高碘酸鈉方法對抗體進行辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記，作為檢測抗體。

1.3.6 建立雙抗夾心ELISA方法

采用棋盤滴定法測定捕捉抗體與檢測抗體稀釋度。用阪崎腸桿菌單抗抗體2A2作為包被抗體（使用 50 mmol·L-1的 Na2CO3-NaHCO3）包被濃度分別為10.000 00 μg·mL-1、5.000 00 μg·mL-1、2.500 00 μg·mL-1、1.250 00 μg·mL-1、0.625 00 μg·mL-1、0.312 50 μg·mL-1及0.156 25 μg·mL-1，以從高到低的稀釋度橫向加入酶標板中（100 μL/孔）37 ℃下孵育2 h。用PBS（1×）3次洗滌包被好的酶標板，再向每孔加入200 μL含有1% BSA的PBS封閉液，于37 ℃下封閉1 h后甩干，每孔分別加入100 μL 2.0×105CFU·mL-1的菌液，以等體積PBS作為空白對照，均37 ℃孵育30 min后用PBS洗滌3次。用PBS將HRP標記的阪崎腸桿菌單抗6A6作為酶標二抗，稀釋濃度與包被抗體一致，每孔縱向加入100 μL稀釋液，最后兩孔分別加入陰性對照與空白對照，于37 ℃孵育1 h后用PBS洗滌4次。每孔再加入100 μL TMB底物顯色液后避光孵育10 min。完成后每孔加入 50 μL 2 mol·L-1的 H2SO4終止顯色反應，用酶標儀進行OD450值檢測。將純化的4株陽性效價高的單克隆抗體分別包被酶標板上，采用雙抗夾心法兩兩配對檢測阪崎腸桿菌，同時選擇陽性、陰性顯色差異最大的配對。

1.3.7 雙抗夾心ELISA方法對阪崎腸桿菌特異性的鑒定

利用建立雙抗夾心ELISA方法對阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157:H7等多種細菌進行檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR法鑒定阪崎腸桿菌

如圖1所示，樣品在目標位置附近都有明顯亮帶，陰性對照（Escherichia coli）及空白對照均無條帶，PCR擴增無污染，該菌液為阪崎腸桿菌。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定阪崎腸桿菌圖

2.2 免疫后小鼠血清的抗體滴度

用2.0×105CFU·mL-1阪崎腸桿菌包被酶標板，將 1#、2#、3#、4#、5#小鼠血清以 1:∶ 103，1 ∶ 104，1∶105倍比稀釋，以免疫前小鼠血清為陰性對照，利用間接ELISA法檢測血清抗體效價，以待檢孔OD450值/陰性對照孔OD450值（P/N值）≥2的最大稀釋度為血清抗體效價。經過4次免疫后的BALB/c小鼠產生的阪崎腸桿菌抗體滴度結果如圖2所示，其中3#老鼠免疫效果最佳。

圖2 免疫后BALB/c小鼠血清的抗體滴度圖

2.3 細胞融合

如圖3所示，第2 d顯微鏡下觀察到融合的雜交瘤細胞無污染且培養的細胞量足。第5 d觀察到融合的雜交瘤細胞呈葡萄串狀集落生長，圓而透亮。第9 d形成穩定的細胞群，此時取其上清液進行抗體檢測。

圖3 雜交瘤細胞集落圖

2.4 雜交瘤細胞的篩選及克隆

經過陽性克隆篩選以及3次克隆后獲得了4株分泌抗阪崎腸桿菌單抗的雜交瘤細胞株，根據其所在培養孔的坐標將其分別命名為2A2、4A9、5A3、6A6。

2.5 單克隆抗體的純化及抗體效價鑒定

將篩選后得到的4株雜交瘤細胞分別注射入5 d前注射過費氏不完全佐劑的BALB/c小鼠腹腔，小鼠產生了3～5 mL腹水，用間接ELISA方法測定腹水中的抗體效價均大于1.0×105。而純化后單克隆抗體的SDS-PAGE圖中一條50 kDa大小的重鏈帶和一條25 kDa大小的輕鏈帶清晰可見，所得抗體具有94%以上的高純度，詳見表1。

表1 抗體效價表

2.6 建立雙抗夾心ELISA體系

將4株細胞株兩兩配對，根據OD450值及P/N值選擇6A6作為酶標二抗，2A2作為包被抗體，經鑒定2抗體均為IgG型且其L鏈均為K鏈，進行的棋盤滴定結果如表2所示。該體系捕捉抗體的最佳包被質量濃度為2.5 μg·mL-1；HRP標記的檢測抗體的最佳稀釋質量濃度為1.25 μg·mL-1，成功建立一種檢測食源性阪崎腸桿菌的雙抗夾心ELISA體系。

表2 棋盤滴定法鑒定結果表

2.7 雙抗夾心ELISA方法的特異性

利用建立的雙抗夾心ELISA方法對阪崎腸桿菌與其他菌種進行特異性試驗，有效檢測阪崎腸桿菌的雙抗夾心ELISA法對其他多種常見食源性致病菌無交叉反應性，見表3。

表3 夾心ELISA法與其他病原菌的交叉反應試驗表

2.8 雙抗夾心ELISA體系標準曲線

如圖4所示，將阪崎腸桿菌菌液按1.0×107CFU·mL-1、2.0×106CFU·mL-1、4.0×105CFU·mL-1、1.0×105CFU·mL-1、2.0×104CFU·mL-1、4.0×103CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1和4.0×102CFU·mL-1逐級遞減稀釋，用此雙抗夾心ELISA體系檢測并建立標準曲線：其對數回歸方程為y=0.357 8x-0.291，R2=0.999。當抗原濃度低于1.0×103CFU·mL-1時，線性擬合不佳，因此建立的雙抗夾心ELISA對阪崎腸桿菌純培養菌液的檢出限為1.0×103CFU·mL-1。

圖4 建立的雙抗夾心ELISA體系標準曲線圖

3 討論與結論

阪崎腸桿菌的檢測是保障食品安全的重點，免疫檢測在檢測阪崎腸桿菌領域有廣泛應用。翟緒昭[13]等建立間接競爭ELISA體系對阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度達到106CFU·mL-1。SONG等根據兔抗坂崎腸桿菌IgG抗體建立的間接酶聯法對純培養的坂崎腸桿菌的檢測范圍為5.6×103～2.1×105CFU·mL-1，且縮短檢測時間至36 h，但其體系與108CFU·mL-1的粉末佛朗哥氏菌存在輕微交叉反應[14]。石曼等研究的雙抗夾心ELISA體系可對克羅諾桿菌屬穆汀斯克羅諾桿菌特異性檢測，經17 h增菌低至0.1 CFU·g-1，接種樣品亦可檢出[15]。PARK等[16]制備兔源IgG抗體為檢測抗體，雞源IgY抗體為捕獲抗體形成檢測坂崎腸桿菌的雙抗夾心ELISA體系的檢測限為2.0×104CFU·mL-1，高于丁銘[17]使用融合蛋白建立的單克隆抗體形成的雙抗夾心ELISA方法的檢測限。多項實驗表明使用阪崎腸桿菌單克隆抗體建立的雙抗體夾心酶聯免疫法在純培養條件下檢測限大多能達到104CFU·mL-1[18-20]。本實驗用成本低、技術成熟、重現性高的雜交瘤技術制備高純度的單克隆抗體6A6、2A2，并建立具有良好敏感性的雙抗夾心ELISA檢測方法，其檢測范圍可達到103CFU·mL-1，對開發診斷試劑盒和其他快速、省時、易于檢測阪崎腸桿菌的工具有重要意義。