亞硝酸鹽含量分光光度法不確定度評定

◎ 司徒茵，凌育昕

（1.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442）

亞硝酸鹽是一種比較典型的肉制品護色劑，在對其進行應用的過程中可以和肉類中的肌紅蛋白發生相應的反應，呈現出比較明顯的色澤優化效果，同時也可以使肉的風味得到進一步的豐富和完善，另外還可以起到防腐的效果。部分不法商家添加過量的亞硝酸鹽，導致食物中毒事件頻發，迫切需要為檢驗人員提供具有指導性的控制要點，從而提高檢測結果的準確性和可靠性。要建立腌臘肉制品中亞硝酸鹽分光光度法測定不確定度的數學模型，通過數學模型對測定中不確定度來源進行分析計算，為有效控制腌臘肉制品中亞硝酸鹽含量測定的質量提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1 000 mL。乙酸鋅溶液（220 g·L-1）：稱取220.0 g乙酸鋅，先加30 mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1 000 mL。飽和硼砂溶液（50 g·L-1）：稱取5.0 g硼酸鈉，溶于100 mL熱水中，冷卻后備用。對氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）：稱取0.4 g對氨基苯磺酸，溶于100 mL 20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）：稱取0.2 g鹽酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。亞硝酸鈉標準溶液液（100 mg·L-1，以氮計）。

1.2 儀器與設備

組織搗碎機，電子天平，分光光度計[1]。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取與凈化

取代表性樣品用組織搗碎機充分搗碎，確稱取已經絞碎均勻的試樣5 g（精確至0.001 g），置于250 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL 50 g·L-1的飽和硼砂，加入70 ℃水150 mL，對其進行混合均勻，然后在沸水中對其進行加熱處理，大約15 min后取出，冷水中進行冷卻，放到室溫的條件下，將提取液轉至200 mL容量瓶中，加入5 mL亞鐵氰化鉀（106 g·L-1），再進一步搖晃均勻融入5 mL乙酸鋅（200 g·L-1）溶液，使蛋白質沉淀下來。加水定容，搖勻，再放置30 min左右，把上面的脂肪進行有效去除，同時用過濾液體和濾紙對其進行相對應的過濾，把初過濾的液體進行去除，并且準備好相對應的濾液，為后續的準備工作提供必要支持。

1.3.2 標準曲線制作

分別吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL水中亞硝酸氮標準使用液（相當于 0 μg、0.2 μg、0.4 μg、0.6 μg、0.8 μg、1.0 μg、1.5 μg、2.0 μg 和 2.5 μg 水中亞硝酸氮）及 40.0 mL 試樣提取液于50 mL比色管中，于標準管和比色管中分別加入2 mL對氨基苯磺酸（4 g·L-1），混勻，放置3～5 min后各加入1 mL鹽酸萘乙二胺（2 g·L-1），加水至刻度線，搖勻，放置15 min，用1 cm比色皿，以零管調節零點，于波長538 nm處測其吸光度，以吸光度A為縱軸，亞硝酸氮的質量為橫軸繪制標準曲線。同時做試劑空白[2]。

2 數學模型

式中：X-試樣中亞硝酸鈉的含量，mg·kg-1；A-試樣中亞硝酸鈉的吸光度值對應的亞硝酸鈉的質量，μg；V1-測定用樣液的體積，mL；V2-試樣處理液總體積，mL；m-取樣量，g；69/14-換算系數；1 000-換算系數。結果保留兩位有效數字。

3 不確定度來源分析

3.1 配制亞硝酸鹽標準溶液濃度引入的不確定度

儲備液使用有證標物，其擴展不確定度為Urel（c1）=0.03、濃度c=100 mg·L-1，k1=2。

標準使用液要用儲備液稀釋100倍，其中用的1 mL移液管、100 mL容量瓶、有檢定證書可得到其允許的最大誤差值（Maximum Permissible Error，MPE）（管1）=0.008、MPE（容1）=0.1，移液管和容量瓶的分辨力δ為0.01mL，

儀器的校準溫度為T1=20.0 ℃，實驗室的溫度在T2=20.0 ℃，水的體積膨脹系數a=2.1×10-4/℃，服從矩形分布，

3.2 標準曲線擬合引入的不確定度

通過相對應的實驗，可以有效明確相對應的標準曲線的相關質量濃度點，然后進一步有效測量不同的物質濃度點，測量3次左右，一共獲得27個數值，即n=27。用xi為橫坐標，yi縱坐標繪制擬合標準曲線，y=0.075x-0.000 5，由此得出a+bxi，見表1。由上可知，標準溶液吸光度測量的試驗標準差為S，計算如下：

表1 亞硝酸鹽標準曲線數據表

標準曲線引入的相對不確定度計算如下：

式中：Urel（x0）-樣液亞硝酸鹽含量的相對標準不確定度；S-標準溶液吸光度測量的試驗標準差；b-擬合曲線的斜率；x0-樣品溶液中亞硝酸鹽含量的平均值，μg；p-樣品溶液測定的次數，p=2；m-標準溶液濃度的個數，m=9；xi-各標準溶液中亞硝酸鹽的含量，μg；標準溶液中亞硝酸鹽含量的平均值μg。

3.3 天平稱量所引入的不確定度

由天平說明書得到電子天平在0～50 g時MPE值為±5 mg，服從矩形分布，k2=。重復稱量同一樣品8次得到稱樣量分別為5.220 2 g、5.220 3 g、5.220 0 g、5.219 8 g、5.220 3 g、5.220 2 g、5.220 1 g、5.220 1 g。

3.4 樣品稀釋引入的不確定度

樣品稀釋用了20 mL移液管、200 mL容量瓶、50 mL容量瓶，有檢定證書可得到其允許的最大誤差值MPE（ 管2）=0.03、MPE（ 容2）=0.15、MPE（ 容3）=0.05，移液管和容量瓶的分辨力δ為0.01mL，k2=。儀器的校準溫度為T1，實驗室的溫度在T2，水的體積膨脹系數a=2.1×10-4/℃，服從矩形分布，k2=。

3.5 紫外分光光度計引入的不確定度

紫外分光光度計由檢定證書得透光率的擴展不確定度為u（A）=0.004，k=2，（在同一波長下測定，波長不確定度忽略不計），則紫外分光光度計引入的不確定度為：

4 合成不確定度

由上述的分析可知，分光光度法測定亞硝酸鹽中引入不確定度的來源有5個，分別是配制亞硝酸鹽標準溶液濃度引入的不確定度、標準曲線擬合引入的不確定度、天平稱量引入的不確定度、樣品稀釋引入的不確定度、紫外分光光度計引入的不確定度。綜合以上5個合成標準不確定度，亞硝酸鹽的合成相對擴展不確定度為[3-6]：

5 結論

通過對分光光度法測定亞硝酸鹽含量的不確定度進行相對應的分析和評定，可以進一步充分明確，影響最終不確定度結果的主要為測量重復性所產生的不確定度。正因為主要來源由測量重復性產生的，所以需要在測定亞硝酸鹽的過程中嚴格控制樣品前處理和測量過程，并多次重復測量，以降低檢測結果的不確定度。